C-C键的不对称合成一直被认为是有机合成领域最具有挑战性的课题之一。醛缩酶催化的羟醛缩合反应已经成为C-C键不对称合成必不可少的工具。在醛缩酶家族中,磷酸二羟基丙酮(DHAP)依赖型醛缩酶是应用最广的一类醛缩酶。该类醛缩酶催化供体DHAP与受体醛的缩合反应,生成的产物具有两个新的立体中心,并且这两个立体中心的构型完全由醛缩酶来决定。幸运的是有四类立体选择性互补的DHAP依赖型醛缩酶,对于一个醛受体来说,理论上可以得到一整套四种可能的非对映异构体。在过去的二十年里,DHAP依赖型醛缩酶成功用于许多稀有单糖及其衍生物的合成。然而对于DHAP依赖型醛缩酶来说,一个最主要的问题是DHAP不稳定且价格昂贵,这个因素限制了这一类醛缩酶的实际合成应用。稀有糖是指在自然界中存在但含量很低的单糖及其衍生物。稀有糖一般具有类似于蔗糖的甜度,但几乎不产生或只产生较少能量。稀有糖在食品、医药、保健等领域具有广泛的应用前景。此外,稀有糖还可以作为起始物合成一些具有生物活性的天然产物。目前大多数稀有糖的合成路线仍然很有限,且往往以比较昂贵的前体物质进行合成,这导致稀有糖的价格依然很高。本论文主要分为两大部分：第一部分内容(第二章)为利用DHAP依赖型醛缩酶在体外进行稀有单糖的合成；第二部分内容(第三章)是在第一部分内容的基础上利用DHAP依赖型醛缩酶在大肠杆菌内进行稀有单糖的合成。我们的最终目标是在大肠杆菌中建立具有潜在的大规模合成稀有单糖及其衍生物能力的平台。在第一部分内容中,我们在大肠杆菌BL21(DE3)中过量表达、纯化出四种DHAP依赖型醛缩酶L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶(RhaD)、L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶(FucA)、D-果糖-1,6-二磷酸醛缩酶(FruA)和D-塔格糖-1,6-二磷酸醛缩酶(TagA)并研究它们在稀有单糖合成中的应用。在第二章第一节中,我们在体外利用RhaD醛缩酶进行稀有单糖的合成。根据文献报道,RhaD醛缩酶可以从外消旋DL-甘油醛中识别L-甘油醛来专一性合成L-果糖。而我们发现RhaD可以接受D-甘油醛为受体,但以D-甘油醛为受体时,RhaD失去了其立体选择性。利用该酶的这一特性,我们同时合成了两种稀有单糖D-山梨糖和D-阿洛酮糖。为了避免使用昂贵且不稳定的底物DHAP,我们采用“一锅四酶法”策略来进行D-山梨糖和D-阿洛酮糖的合成。我们以较为便宜且稳定的底物L-3-磷酸甘油为前体,在磷酸甘油氧化酶(GPO)的作用下,L-3-磷酸甘油被氧化生成DHAP。为了解决氧化反应生成的副产物过氧化氢对GPO的抑制作用,我们同时加入过氧化氢酶用来分解过氧化氢并再生氧气。在醛缩酶RhaD的催化下,生成的DHAP与D-甘油醛进行缩合反应,得到的缩合产物在酸性条件下被酸性磷酸酶(AP)脱掉磷酸基团,得到终产物D-山梨糖和D-阿洛酮糖。通过HPLC测定出D-山梨糖和D-阿洛酮糖的比例约为1：1。经过硅胶纯化和P-2凝胶纯化,得到D-山梨糖和D-阿洛酮糖的混合物,总产率为48%。这两种单糖可以通过Ca2+交换树脂进行分离得到纯的D-山梨糖和D-阿洛酮糖。在相同的反应条件下,当我们使用L-甘油醛作为受体时,只得到一种稀有单糖L-果糖,纯化后的产率为66%。这表明醛受体的构象会影响RhaD的立体选择性。由于GPO具有立体选择性,可专一性识别L-3-磷酸甘油,我们使用更便宜的DL-3-磷酸甘油来代替L-3-磷酸甘油,从而进一步降低成本。在第二章第二节中,我们利用FucA醛缩酶在体外进行稀有单糖的合成。我们首先利用来源于大肠杆菌的FucA醛缩酶FucA采用“一锅四酶法”策略以L-3-磷酸甘油为起始物,以D-甘油醛为受体,进行D-阿洛酮糖的合成。然而,经过硅胶纯化和P-2凝胶纯化后,只得到产率为12%的D-5可洛酮糖。根据文献报道,来源于嗜热细菌的酶类在生物合成方面显示了很大的潜能。为了提高产率,我们将注意力转向嗜热菌来源的FucA醛缩酶。我们发现来源于嗜热栖热菌HB8的FucA醛缩酶(FucAT.HB8)的晶体结构已经解析,但其合成应用还没有被研究。因而我们在大肠杆菌BL21(DE3)中过量表达并纯化FucAT.HB8,采用“一锅四酶法”在相同的条件下,利用该醛缩酶进行稀有单糖的合成。比较可喜的是,同大肠杆菌来源的FucA相比,产率从12%提高了到67%。结果显示：当FucAT.HB8以D-甘油醛为受体时,显示了宽泛的立体选择性,除了生成D-阿洛酮糖作为主要产物外,还有少量的D-山梨糖生成。通过HPLC测得,D-阿洛酮糖/D-山梨糖的比例约为5：1。为了进一步降低成本,我们使用DL-3-磷酸甘油来代替L-3-磷酸甘油。我们发现当FucAT.HB8以L-甘油醛为受体时,该酶失去了其立体选择性,生成两种稀有单糖L-果糖和L-塔格糖。通过HPLC测得L-果糖/L-塔格糖的比例为约1.2：1。经过硅胶和P-2凝胶排阻层析纯化,得到L-果糖和L-塔格糖的混合物,总的产率为47%。这两种单糖可以通过Ca2+交换树脂进行分离得到纯的L-果糖和L-塔格糖。在第二章第三节中,我们分别利用来源于兔子肌肉和肉葡萄球菌的果糖-1,6-二磷酸醛缩酶(RAMA和FruAS.car)采用“一锅法”策略,以甘油醛和一系列脂肪醛(乙醛、丙醛、丁醛、戊醛)为受体,合成出相应的多种酮糖。在我们的反应条件下,FruAS.car显示了同RAMA相似的催化活性。在我们以前的研究中,RhaD和FucA催化反应得到的产物通常为非对映体的混合物,并且受体醛的构象会影响醛缩酶的立体选择性。与RhaD和FucA所不同的是,RAMA和FruAS.car都显示了都非常高的立体选择性,对于每个反应,只分离得到唯一产物并且每个产物都通过NMR进行鉴定。对于这两种FruA醛缩酶,以脂肪醛为受体得到相应产物的立体构象与以甘油醛为受体得到的产物构象保持一致。由于FruA醛缩酶在合成化学中具有非常广泛的作用,该方法也可以应用于其他具有生物学功能的糖类及其衍生物的研究。在第二章第四节中,我们在大肠杆菌BL21(DE3)中过量表达并纯化出三种不同细菌来源的D-塔格糖-1,6-二磷酸醛缩酶(TagA)。然而通过TLC测得这三种来源的TagA活性都很低,故没有详细研究该酶在稀有单糖合成中的应用。在第三章中,我们建立了具有潜在的大规模合成稀有单糖及其衍生物能力的平台。近几年来利用便宜的可再生底物作为碳源,通过微生物发酵来生产有用的化合物越来越受到关注。同化学方法相比,微生物发酵反应条件温和,成本低,对环境更加友好,前景广阔。我们的合成策略：首先在大肠杆菌中构建重组质粒同时表达DHAP依赖型醛缩酶和磷酸酶。以葡萄糖(甘油)为绿色碳源,利用该重组大肠杆菌的糖酵解代谢途径(甘油代谢途径)在胞内产生供体DHAP,而受体醛不断地添加到在培养基中。在醛缩酶的催化下,内源产生的DHAP与进入胞内的醛受体进行羟醛缩合反应得到糖-1-磷酸,然后后者在合适的磷酸酶(比如YqaB磷酸酶)作用下,脱掉磷酸基团得到不含有磷酸基团的稀有单糖。由于产物不含有高极性的磷酸基团可以很容易地透过细胞膜释放于发酵液中,便于分离和纯化,同时磷酸基团可以在胞内再生。在这一章中,我们成功地将DHAP依赖型醛缩酶(RhaD、FucA和FruA)催化的羟醛缩合反应引入到大肠杆菌工程菌中,建立了具有潜在的大规模合成稀有单糖及其衍生物(如D-阿洛酮糖、D-山梨糖等其他酮糖)能力的平台。我们的产物由两部分组成,1,2,3位的三个碳原子是从供体DHAP而来,其余的碳原子是从受体醛而来。理论上,如果使用C全标记的葡萄糖做为唯一碳源,在胞内产生的DHAP的三个碳原子将被标记,使得产物的1,2,3位的三个碳原子被标记。为了证明产物中的这三个碳原子最终来源于葡萄糖,我们进行了同位素标记实验。我们以共表达FruA醛缩酶和YqaB磷酸酶的大肠杆菌作为工程菌,以13C全标记的葡萄糖为唯一碳源,以丙醛为受体。发酵终了后,产物经过分离纯化及CNMR鉴定,证实产物中1,2,3位的三个碳原子确实被13C所标记,从而证明了这三个碳原子最终是从葡萄糖而来。我们将来的计划主要包含两方面内容：1通过系统生物学与合成生物学相结合,来提高稀有单糖及其衍生物的产量。2利用大肠杆菌系统合成一些其他具有生物活性的糖化合物,比如可以作为糖苷酶抑制剂的亚氨基环醇类化合物。我们相信这些研究将为食品和制药行业提供一个良好的技术平台。