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盐害降低作物的产量和品质,磷酸化修饰作为一种重要的翻译后修饰过程,广泛的参与生命活动的所有代谢过程,磷酸化修饰组学作为植物逆境研究的新型手段被广泛应用。课题组前期收集了近千份谷子种质资源,以之为材料结合水培及NaCl模拟盐害对其耐盐性进行了筛选,在获得部分具有耐盐潜力谷子品种的基础上,进一步选取萌发期耐盐品种豫谷2(YG2)及盐敏感品种安04(AN04)进行盐胁迫下谷子根部磷酸化修饰组学分析,解析谷子在蛋白修饰水平上参与盐胁迫响应的机制;同时在前期获得谷子类受体蛋白激酶基因SiRLK35异源转化水稻的过表达株系的基础上,对转基因水稻在盐胁迫下的表型、部分盐胁迫指标及响应基因的表达模式进行检测和验证,解析谷子SiRLK35参与盐害响应的可能机制。研究结果如下:1.将收集到的近千份谷子种质资源通过大田试验,初步筛选出四种品种济谷11(JG11)、YG2、豫谷11(YG11)、AN04,结合实验室进一步获得萌发期耐盐品种YG2、盐敏感品种AN04。前人报道胁迫下胞内pH值变化与品种抗逆性相关,故利用BCECF-AM荧光染料和激光共聚焦显微镜,对盐处理前后YG2及AN04根部细胞内的pH值进行测定,结果显示盐胁迫下YG2根部细胞内pH变化程度较小,验证了YG2耐盐性好于AN04,YG2对盐害的耐受力较高;2.采用150mmol·L-1 NaCl模拟盐胁迫,处理萌发期谷子YG2和AN04,对根部蛋白的磷酸化修饰进行研究,共鉴定到5925个磷酸化修饰蛋白及19148个磷酸化位点,其中被磷酸化的86%为丝氨酸(Ser),10%为苏氨酸(Thr),4%为酪氨酸(Tyr);通过对磷酸化修饰位点的Motif分析,发现14个显著富集的磷酸化基序,主要被MAPK、CDK、CDOK、AGC、CaMK-II、PKA、PKC等识别。通过对差异磷酸化修饰组进行GO及COG分析发现,鉴定到的盐胁迫相关的磷酸化修饰蛋白主要参与代谢、转录、翻译、蛋白质加工等过程的调控。其中主要通过ABA信号转导途径、Ca2+信号转导途径、抗氧化胁迫信号通路、以及抗坏血酸合成途径等参与谷子盐胁迫响应过程;3.前期实验室通过iTRAQ技术筛选到的一个干旱响应的类受体蛋白激酶基因SiRLK35,进一步分析显示SiRLK35基因响应盐胁迫,因此通过构建双元植物表达载体pCAMBIA1301P-SiRLK35,获得谷子SiRLK35过表达转基因水稻株系,分别为过表达株系(over-expression,OE)-1(OE-1)、OE-2和OE-3,以水稻中花11为对照,在对照及150 mmol·L-1 NaCl处理下检测各株系中SiRLK35的表达情况,并进行表型观察、生理指标测定和部分盐害响应基因的表达模式分析,结果如下:(1)谷子SiRLK35在过表达水稻株系OE-1中的相对表达量最高;在150mmol·L-1 NaCl处理后,统计过表达水稻株系及中花11的根长、株高、地上部分和地下部分干重、死亡率、死叶率,发现盐害下过表达株系植株生长受抑制程度较对照小,且SiRLK35表达量高的OE-1受抑制程度最小;说明谷子SiRLK35异源转化水稻获得的过表达株系对盐胁迫具有一定的抗性;(2)盐胁迫下进行3,3’-二氨基联苯胺(3,3’-Diaminobenzidine,DAB)和氮蓝四唑(nitrotetrazolium blue chloride,NBT)染色及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和过氧化物酶(peroxidase,POD)活性测定发现,抗性较强的OE-1株系在盐害下O2-和H2O2积累程度低于对照、且对活性氧的清除能力较高,因此SiRLK35及其高表达可使植物产生并提高耐盐能力;(3)对部分盐害响应基因在SiRLK35过表达株系中的相对表达量分析发现,部分盐胁迫响应基因在盐处理后表现为上调,其中,OsLEA3在盐处理24 h的相对表达量是对照中的1.9倍,而OsHKT1的表达虽然在盐处理6 h表现为上调,但之后随盐处理时间的延长而表达降低;因此谷子SiRLK35可能主要通过影响过氧化物的清除机制、调控下游胁迫响应基因如OsLEA3及OsHKT1等的表达及信号途径来提高水稻耐盐性。