TNF-α(tumor necrosis factor, TNF-α)主要由活化的T细胞、单核/巨噬细胞、NK细胞产生并分泌,具有多种不同的生物学功能。它以两种生物活性形式存在:26kD的跨膜型TNF-α(mTNF-α)和17kD的分泌型TNF-α(sTNF-α)。mTNF-α是sTNF-α的前体,在TNF-α转换酶(TACE)的作用下,其胞外段被切割,脱落成sTNF-α。近年研究发现,mTNF-α和其受体结合后,不仅可以启动受体后的信号传导,即正向信号,而且能向自身所在的细胞传递信号,即“反向信号”(reverse signaling),并引起相应的生物学效应。研究表明,mTNF-α反向信号的产生、传递与其胞浆段的结构密切相关。mTNF-α的信号肽(signal peptide,SP)由76个氨基酸组成,包括连接段,跨膜段和胞浆段,其胞浆段参与mTNF-α反向信号的传递,但是其反向信号通路尚不清楚。TRAF(Tumor necrosis factor receptor associated factor)是一类与TNFR超家族成员直接或间接结合的细胞内接头分子,迄今已发现六种哺乳动物的TRAF家族成员,可诱导多种激酶的活化,最终介导一系列信号传递途径如NF-κB、JNK等,从而调节细胞增殖,分化和凋亡。运用免疫共沉淀技术,我们的前期研究发现TRAF1可与mTNF-α共沉淀,提示TRAF1可能与mTNF-α的胞浆段以直接或间接的方式结合,传递反向信号。本课题借助分子生物学的方法构建TNF-SP-EGFP重组质粒,与TRAF1-pDsRedN1,瞬间共转染真核细胞系COS-7,研究TNF-SP和TRAF1二者在细胞内的共定位,从而为进一步阐明mTNF-α反向信号转导的分子机制奠定基础。一. TNF-SP-EGFP重组质粒的构建、克隆及鉴定1.重组质粒的构建和克隆:以TNF-SP-PcDNA3.0质粒为模板,PCR扩增获取TNF-SP目的基因,用EcoRI和BamHI对目的基因和pEGFP-N1载体进行双酶切,并用T4DNA连接酶连接,将连接产物转化DH5α感受态细菌,挑选阳性克隆。2.阳性克隆的鉴定:以菌落PCR初步筛选阳性克隆,再用上述限制性内切酶双酶切鉴定,结果显示:重组质粒经酶切得到228bp的目的片断,与所连接的目的基因大小一致。进一步DNA测序分析,证实重组质粒包含TNF-SP的编码区,且无突变和移码。提示TNF-SP-EGFP重组质粒构建成功。二.TNF-SP-EGFP融合蛋白在真核细胞的表达及定位将TNF-SP-EGFP融合蛋白重组质粒瞬时转染COS-7细胞,在荧光显微镜下可见EGFP的绿色荧光及与TNF-SP特异性结合抗体上标记的红色荧光,说明TNF-SP-EGFP融合蛋白在COS-7细胞中成功表达。将所转染的细胞进行PI染色,并在激光共聚焦显微镜下观察,显示绿色荧光呈点状分布于细胞浆,说明TNF-SP-EGFP融合蛋白在细胞浆表达。而间接荧光则显示TNF-SP也可在细胞膜上表达。三.TNF-SP与TRAF1的细胞内共定位将TNF-SP-EGFP与TRAF1-pDsRedN1共同转染于COS-7细胞,在荧光显微镜下观察发现TNF-SP-EGFP与TRAF1-pDsRedN1发生荧光重叠,显示为黄色荧光,提示TNF-SP与TRAF1共定位于细胞浆, SP可能与TRAF1的N端结合。结论:1.成功构建了TNF-SP-EGFP重组质粒,且在COS-7真核细胞中得以表达。2.间接免疫荧光方法和激光共聚焦显微镜显示TNF-SP表达于细胞膜和细胞浆。3.初步实验证实TNF-SP与TRAF1共定位于细胞浆,且TNF-SP可能与TRAF1蛋白N末端结合。