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体细胞核移植(Somatic Cell Nuclear Transplantation,SCNT)是一个复杂、多步骤的哺乳动物克隆技术,包括卵母细胞成熟、供体细胞周期同步、去核、细胞融合、卵母细胞激活和胚胎培养发育等过程。其中卵母细胞体外成熟(IVM)不仅为SCNT提供大量优质的成熟卵母细胞受体,对体外受精(In Vitro Fertilization,IVF)、单精注射(Intracytoplasmic Sperm Injection,ICSI)等技术也有非常重要的意义。卵母细胞作为受体细胞为重编程提供了微环境,因此卵母细胞的质量(是否与体内自然成熟的卵母细胞作用特征相同)就显得尤为重要;另外供体细胞提供了基因组,其染色质状态直接关系到核重编程是否能顺利进行。此外,要启动重构胚的发育,供体细胞与卵母细胞发育周期同步也是必要条件。本实验就从上述两个方面入手:一方面通过在猪培养体系中分别加入不同的激素刺激因子(RosA、pNPPBB/E2、FGF2、LIF、IGF1、LH),研究其能否改善猪卵母细胞质量,提高孤雌胚胎发育能力;另一方面探究了供体传代次数及直径体积大小这些供体细胞参数及供体细胞与卵母细胞发育周期同步对猪SCNT后植入前胚胎发育的影响。首先,本实验对卵母细胞成熟的100nM pNPPB/100nM E2最佳处理时间和RosA、FGF2、LIF、IGF1的最优处理浓度进行研究。结果显示:1.使用的100nM pNPPB/100nM E2对卵母细胞处理2h时后,进行体外培养时卵母细胞成熟的效率较好,处理1h时,孤雌胚的分裂率及囊胚率有明显提高;2.LH的最佳培养浓度为5ng/ml,在此浓度下,培养成熟的卵母细胞与对照组相比其成熟及发育无明显差别;3.IGF1、LIF、FGF2 最佳浓度分别为 15ng/ml、15ng/ml、25ng/ml 时,对卵母细胞进行培养均有效的促进了其成熟率及囊胚率;4.RosA最佳浓度在5μM时,卵母细胞的成熟率、及孤雌后胚胎的囊胚率有上升趋势。在此基础上,使用不同激素组合(pNPPB/E2+FLI+RosA、pNPPB/E2+FLI、pNPPB/E2+RosA、FLI+RosA)对卵母细胞进行培养,然后孤雌观察胚胎发育状况。结果显示,pNPPB+FLI与对照组相比其成熟率、卵裂率并无明显差异,囊胚率呈明显上升趋势,其它组合pNPPB/E2+FLI+RosA、FLI+RosA与pNPPB/E2+RosA对卵母细胞的成熟和发育无明显效果,可能还存在不利的影响。然后,本实验探究了供体细胞对猪SCNT效率的影响。用不同传代次数(F1-F10)的猪胎儿成纤维细胞作为供体细胞进行SCNT并观察植入前胚胎发育情况,结果显示供体细胞在F7-F8代时SCNT效率较好。而且,供体细胞直径大小不会对SCNT后的重构胚的发育产生显著影响,但对后期胚胎的囊胚细胞数及凋亡有一定的影响。综上所述,本实验探究了不同刺激激素对卵母细胞体外成熟的影响和供体细胞状态对SCNT胚胎发育的影响,为以后提升卵母细胞体外成熟及核移植效率方面的研究提供了参考。