嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor,CAR）是根据T细胞激活的双信号学说人工合成的包含抗原识别结构域和T细胞激活结构域的嵌合分子。CAR基因修饰的T细胞（CAR-T）识别靶抗原后可有效激活并特异性杀伤表达靶抗原的肿瘤细胞。目前,CAR-T疗法在肿瘤治疗领域取得了突破性进展。靶向CD19蛋白的CAR-T细胞治疗复发难治性B细胞白血病完全缓解（complete remission,CR）率高达90%。由于靶点的非特异性,CAR-T细胞会攻击低表达靶抗原的正常组织细胞,产生脱靶效应（on-target off-tumor）。在血液瘤治疗方面,CAR-T细胞会清除正常的B细胞,增加患者感染风险;在实体瘤治疗方面,CAR-T细胞会靶向肝、肺等重要组织器官,造成器官功能衰竭,危及患者生命。脱靶效应是CAR-T临床应用中,特别是实体瘤治疗中迫切需要解决的难题。本研究设计了一个包含杀伤免疫球蛋白样受体（killer cell immunoglobulin-like receptor,KIR）胞外段和程序性死亡受体1（programmed cell death protein 1,PD-1）胞内段的新型抑制性嵌合抗原受体（KIR/PD-1-based inhibitory CAR,i KP CAR）分子。i KP CAR胞外识别域KIR识别人类白细胞抗原（human leukocyte antigen,HLA）后激活胞内信号域PD-1,向T细胞传递抑制性信号。因为HLA在正常组织中高表达,i KP CAR识别正常组织时激活PD-1信号,抑制CAR-T细胞的活化,防止CAR-T细胞对正常细胞的杀伤;而肿瘤细胞低表达或不表达HLA,i KP CAR的抑制性信号不能被激活,从而CAR-T细胞被活化并对肿瘤细胞发挥杀伤作用。我们在临床常用的CD19-CAR-T细胞和HER2-CAR-T细胞中共表达i KP CAR,通过体外和体内实验探讨它们是否具有杀伤肿瘤细胞而对正常细胞没有杀伤作用,从而有望解决CAR-T细胞脱靶效应这一难题。首先,我们发现i KP CAR不影响T细胞表达激活型CAR及T细胞增殖、活性、CD8+/CD4+亚群变化;然后,我们检测了i KP CAR识别HLA后胞内PD-1信号通路,结果显示i KP CAR通过对CAR-T细胞激活信号通路中的关键蛋白P-Zap70去磷酸化,进而抑制了CAR-T细胞的活化。最后,我们证明了表达i KP CAR的CD19-CAR-T（i KP-19-CAR-T）细胞在体外可以有效杀伤CD19+HLA-C1-的伯基特氏淋巴瘤细胞株Daudi,而对CD19+HLA-C1+的健康人B细胞杀伤效果显著降低。动物实验结果表明i KP-19-CAR-T细胞在清除免疫缺陷小鼠体内Daudi细胞的同时保存了健康人B细胞,而CD19-CAR-T细胞同时清除了小鼠体内的Daudi细胞和健康人B细胞。另外,我们发现无论是体外还是体内,i KP-19-CAR-T细胞会表达更低的衰竭分子PD-1,产生更多的中央记忆型T细胞(central memory T cell,TCM),释放更少细胞因子。在实体瘤治疗方面,我们同样在体外和体内证明表达i KP CAR的HER2-CAR-T（i KP-HER2-CAR-T）细胞能有效清除HER2+HLA-C1Low的胃癌细胞株MGC803,而对HER2+HLA-C1HighMGC803杀伤效果显著降低。对i KP-HER2-CAR-T细胞相关表型进行检测,结果也与i KP-19-CAR-T细胞一致。总之,本课题发明了一个基于KIR/PD-1的抑制性CAR分子,分别从血液瘤和实体瘤治疗方面证明表达i KP CAR的CAR-T细胞能够选择性杀伤不表达或低表达HLA的肿瘤细胞,同时显著降低对正常表达或高表达HLA的正常组织细胞的毒性,从信号调控的角度为解决CAR-T细胞的脱靶效应提供了一条新方案。