研究背景与目的:近些年来,由于人类饮食结构和生活习惯的变化,高热量食物的过量摄入和缺乏足够的运动导致肥胖人数飞速增长。肥胖和肥胖引致的胰岛素抵抗是2型糖尿病及心血管疾病、高血压等发生的重要原因。预防肥胖可有效减少糖尿病和心血管疾病等发生的风险。我们的前期研究显示树豆叶二苯乙烯类单体成分在ob/ob肥胖糖尿病小鼠模型上具有降糖减重作用。为了对树豆叶进行进一步的开发利用,本课题拟对树豆叶提取物在降血糖、减肥方面的作用进行实验研究,并考察其和文献报道的具有改善血脂功效的三七总皂苷、二苯乙烯苷联合使用是否具有协同增效作用。研究方法:1.体外研究(1)以3T3-L1小鼠前脂肪细胞为模型,评价树豆叶不同浓度乙醇的提取物、二苯乙烯苷、三七总皂苷对细胞增殖的影响。(2)对3T3-L1进行成脂分化诱导,采用油红O染色法观察分化成熟的脂肪细胞。评价树豆叶不同浓度乙醇的提取物、三七总皂苷、二苯乙烯苷及其组合对脂肪细胞分化的作用。(3)采用分化成熟的小鼠3T3-L1脂肪细胞为模型,通过和地塞米松(DEX)共孵育诱导胰岛素抵抗。在此基础上评价树豆叶不同浓度乙醇的提取物、二苯乙烯苷、三七总皂苷修复细胞胰岛素敏感性,增加葡萄糖消耗的能力。筛选出具有显著抑制脂肪分化活性与修复胰岛素敏感性作用的树豆叶醇提物(简称“树豆叶有效醇提物,SDE”)。2.体内研究(1)高糖高脂饮食诱导肥胖和糖代谢异常Wistar同龄雄性大鼠,采用高脂高糖饲料饲养,以模拟人糖脂代谢异常的发生过程。定期检测体重。十五周后,测定空腹血糖浓度和口服葡萄糖2小时后血糖浓度。和正饲养的同龄大鼠比较,确定是否出现超重和糖代谢异常。(2)药物干预对糖代谢异常大鼠体重、糖脂代谢的影响选择造模后空腹血糖大于6.0 mmol/L的大鼠随机分为7组(N=6)。在继续高脂高糖饮食条件下,连续8周分别灌胃给予阳性药二甲双胍(Metformin组)(100 mg/kg/d)、树豆叶有效醇提物100 mg/kg/d(SDE100组)、三七总皂苷-二苯乙烯苷1:1(w/w)混合物 100 mg/kg/d(DG100 组)、DG 100 mg/kg/d+SDE 100 mg/kg/d、DG 100 mg/kg/d+SDE 50 mg/kg/d、DG 50 mg/kg/d+SDE 100 mg/kg/d、或等量的空白溶剂(Control组)进行干预。每周一次检测空腹血糖和体重。治疗开始和治疗结束时测定口服葡萄糖耐受性(OGTT)。治疗结束时腹主动脉采空腹血,测定血清胰岛素(Insulin)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、血浆胰岛血糖素样肽(GLP-1),评价药物干预对大鼠体重、糖脂代谢的影响。采用基础饲料饲养的同龄雄性大鼠(6只)作为正常对照(Normal组)。研究结果:1.体外实验结果(1)测试了 95%、80%、60%、40%、20%乙醇(v/v)提取的树豆叶提取物、二苯乙烯苷、三七总皂苷在不同浓度下(200-12.5 μg/mL)作用于3T3-L1前脂肪细胞48小时,对细胞增殖活力的影响。结果发现树豆叶不同浓度乙醇提取物和二苯乙烯苷对细胞增殖活力的抑制作用较弱,在100 μg/mL时抑制率均小于20%;三七总皂苷对细胞增殖抑制作用相对较强,在100 μg/mL时的抑制率大于55%。(2)测试了 95%、80%、60%、40%、20%乙醇(v/v)提取的树豆叶提取物、二苯乙烯苷、三七总皂苷在40、20、10 μg/mL浓度下,二苯乙烯苷-三七总皂苷二者在各自40、20和10浓度μg/mL下等体积混合后,以及树豆叶80%乙醇提取物-二苯乙烯苷-三七总皂苷三者在在各自40、20和10浓度μ g/mL下等体积混合后,对3T3-L1前脂肪细胞成脂分化的影响。结果发现:测试样品在单独作用时,①树豆叶95%或80%乙醇提取物在高剂量(40 μg/mL)时对前脂肪细胞分化有显著抑制作用;树豆叶其他浓度乙醇提取物对脂肪细胞分化则无明显抑制作用或无抑制作用。树豆叶减脂活性提取物为高浓度醇提物,即95%和80%乙醇提取物。②三七总皂苷能剂量依赖地显著抑制脂肪细胞分化,在40 μg/mL浓度时抑制效果最强,抑制率约52%;联合作用时,③三七总皂苷-二苯乙烯苷混合物、树豆叶80%乙醇提取物-三七总皂苷-二苯乙烯苷1:1:1混合物都能剂量依赖地显著抑制成脂分化,但抑制活性没有超过相同浓度的三七总皂苷。(3)跟未经DEX诱导的正常3T3-L1脂肪细胞(DEX-)相比,和DEX共孵育48小时的3T3-L1脂肪细胞(DEX+)培养基中葡萄糖剩余明显增加(1.53 mmol/L vs 5.42 mmol/L,DEX-vs DEX+),说明DEX诱导脂肪细胞胰岛素抵抗状态成立。在此基础上测试了 95%、80%、60%、40%、20%乙醇提取的树豆叶提取物、二苯乙烯苷、三七总皂苷促进诱导胰岛素抗性3T3-L1脂肪细胞葡萄糖消耗的能力。发现树豆叶的80%乙醇提取物在20 μg/mL浓度时修复胰岛素敏感性、促进葡萄糖消耗的能力最强。我们的实验结果表明,具有显著减脂活性与修复胰岛素敏感性作用的树豆叶醇提物(简称“树豆叶有效醇提物,SDE”)是树豆叶80%乙醇提取物。2.体内实验结果(1)高糖高脂饲料诱导饲养导致了雄性Wistar大鼠体重超重、糖代谢异常和10只正常饲养的同龄大鼠(Normal)相比,90只连续十五周给予高糖高脂饲料饲养的大鼠平均体重有明显增加(461.5±24.1 g vs 524.2±53.7 g,Normal vs Control,P<0.0001),平均空腹血糖值有明显增加(5.18±0.41 mmol/L vs 6.10±0.66 mmol/L,Normal vs Control,P<0.001)、平均口服葡萄糖2小时后血糖值有明显升高(6.16 ±0.46 mmol/L vs 6.80 土 0.92 mmol/L,Normal vs Control,P<0.05)。说明高糖高脂饲料饲养可诱导大鼠体重超重和糖代谢异常。其中空腹血糖大于6.0 mmol/L的大鼠有42只,其空腹血糖均值、口服葡萄糖两小时后血糖均值分别为为6.72±0.72 mmol/L和7.09±1.14 mmol/L,体重均值为 523.6±45.8 g。(2)中药提取物及其组合物干预对大鼠体重和糖脂代谢有一定的调节作用体重:阳性药物(二甲双胍)、中药提取物及其组合物干预组大鼠体重增长都较模型组(Control)有所减缓。其中,DG100组、DG 100 mg/kg+SDE 50 mg/kg组大鼠在给药结束时体重明显低于Control组(p=0.043<0.05;p=0.036<0.05);其他组大鼠体重和Control组相比无显著性差异。空腹血糖:在8周的药物干预过程中,Control组空腹血糖未见进一步升高,甚至还有所降低,但与正常组始终保持明显差异(P<0.05)。药物干预各组和模型组相比,空腹血糖水平无差异。OGTT:和Normal组相比,Control组大鼠口服葡萄糖后不同时间点血糖水平和OGTT曲线下面积都明显升高。和Control组相比,药物干预组口服葡萄糖后不同时间点血糖值略低,OGTT曲线下面积偏低,其中以DG100+SDE50组OGTT改善最多,但都无统计学意义。血清胰岛素水平:和Normal组相比,Control组血清胰岛素水平显著升高(P=0.006<0.01),说明可能存在胰岛素抵抗。和Control组相比,各药物干预组大鼠血清胰岛素水平都有所下降。其中Metformin组、DG100组、SDE100组血清胰岛素水平下降有统计学意义(P=0.029;P=0.013;P=0.041<0.05)。血浆GLP-1水平:Normal组、Control组、DG100组大鼠血浆GLP-1水平无差异。含有SDE的各干预组血浆GLP-1水平较模型组有一定程度的升高,但无统计学意义。血清血脂四项:和Normal组相比,Control组大鼠血清LDL-C水平无差异,TC水平略有升高但无统计学意义,HDL-C水平有显著升高(P=0.034<0.05),TG无升高,提示模型组可能存在轻微的脂代谢异常。和Control组相比,药物或中药提取物干预组大鼠血清LDL-C水平无差异;TC、HDL-C和TG水平则都有所降低。其中,Metformin组大鼠血清TC和HDL-C和TG水平有明显降低(P<0.05;P<0.01;P<0.05),SDE100组大鼠血清HDL-C水平、SDE100-DG100组大鼠血清TC 水平都有明显降低(P<0.05)。结论:(1)树豆叶80%乙醇提取物、二苯乙烯苷和三七总皂苷单独或联合作用,都能显著抑制3T3-L1前脂肪细胞的成脂分化。(2)树豆叶80%乙醇提取物能显著逆转地塞米松诱导的3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗、促进葡萄糖消耗。(3)树豆叶80%乙醇提取物(50 mg/kg),二苯乙烯苷(50 mg/kg),三七总皂苷(50 mg/kg)联合使用对高糖高脂饮食诱导的糖脂代谢异常Wistar大鼠体重的异常增加具有显著改善作用;树豆叶80%乙醇提取物(100 mg/kg)可显著降低血清HDL-C和胰岛素水平;树豆叶80%乙醇提取物(100 mg/kg),二苯乙烯苷(50 mg/kg),三七总皂苷(50 mg/kg)能够明显降低模型大鼠血清的TC水平;二苯乙烯苷(50 mg/kg)和三七总皂苷(50 mg/kg)联合使用可使造模大鼠偏高的血清胰岛素水平显著回调。说明树豆叶80%乙醇提取物及其与其他中药提取物如二苯乙烯苷何三七总皂苷的组合物,可在一定程度上改善大鼠的糖代谢和脂代谢。