茶(Camellia sinensis)是世界上最受欢迎的饮料之一,特别是在中国、日本、印度和泰国等亚洲国家作为饮食和药物应用已经有超过5000年的悠久历史。其中,茯砖茶(FBT)主要产于中国湖南省,是所有茶类中加工工艺最复杂、最独特的黑茶产品之一,FBT加工过程中因冠突散囊菌(Eurotium cristatum)为主的真菌发酵作用而产生金黄色的斑点,俗称“金花”,也是区别于其它黑茶的重要特征。FBT具有抗氧化、抑菌、调节脂代谢等多种生物功效,被认为是西南边疆地区藏族、维吾尔族和蒙古族等日不可少的必需饮品。目前对FBT中的活性成分和调节脂代谢的功效已开展了广泛而深入的研究,但是由于FBT的组成非常复杂,因此FBT调节脂代谢机理及哪种成分发挥生物活性作用尚不清楚。越来越多的研究表明肠道微生物与人体健康关系密切,特别是对宿主脂代谢和能量代谢有直接的影响,调节肠道微生态对调节宿主代谢、保持人体健康具有重要意义。近年来的研究表明膳食多糖在唾液、胃液及小肠中均不会被消化吸收,从而顺利到达大肠被肠道微生物所利用,因此利用膳食多糖干预改善肠道菌群成为调节代谢综合征(MS)的新靶点。本课题以边疆人民喜爱的FBT为原料,系统地探究了 FBT对缓解小鼠高脂膳食诱导的MS及对肠道微生物的调节作用,并从FBT中分离、纯化出茯砖茶多糖(FBTPS),并通过体外模拟研究FBTPS在口腔和胃肠道中的消化过程及对肠道微生物的影响,在体外实验的基础上以高脂膳食小鼠为模型研究FBTPS干预对小鼠MS和肠道微生物的影响,对确定FBT中活性成分和阐述FBT的活性作用机制具有重要意义。主要研究内容及结果如下:1、茯砖茶缓解小鼠高脂饮食诱导的MS本节采用C57BL/6J小鼠模型,研究了 FBT对高脂膳食小鼠的MS和肠道微生物的影响。结果表明FBT干预可以缓解高脂饮食小鼠体重增加、脂肪积累、肝脏重量以及肝脏中甘油三酯(TG)的含量,并且FBT可以显著降低血清中TG和低密度脂蛋白-胆固醇(LDL-C)的水平。同时FBT能改善高脂诱导的肝脏氧化损伤,降低血清中LPS、TNF-α、IL-6和CRP水平,并降低肝脏中FAS、SREBP-1c和PPARγ脂合成相关基因的表达水平。FBT能够调节肠道微生物的多样性和菌群的整体结构,其中FBT干预可以显著降低Firmicutes相对丰度、增加Bacteroidetes相对丰度,从而降低Firmicutes/Bacteroidetes 的比例。在科水平 FBT 可以显著增加 Bifidobacteriaceae 相对丰度,在OTUs水平FBT调节了 58个高脂膳食改变的OTUs。综合来看,FBT在调节MS和肠道微生物方面均均具有优异的效果,然而相关机制还需要进一步研究。2、FBTPS的理化性质、细胞毒性及抗氧化活性的评价本节从9种不同来源的FBT中提取了 9种FBTPS,分别研究FBTPS的理化性质和细胞毒性,同时利用化学抗氧化、细胞抗氧化和动物实验评价FBTPS的抗氧化活性。结果表明9种FBTPS粗品具有相似的化学组成,中性糖含量在45.2±3.3-59.4±2.3%范围内,蛋白含量均小于5%,多酚含量在4.2±0.1-10.3±0.3 mg GA/100 mg范围内,FBTPS糖醛酸含量在31.8±1.4-41.6±1.4%范围内,具有高糖醛酸含量,因此FBTPS为典型的酸性多糖。FBTPS主要是由Man、Rha、GalA、Glc、Gal、Ara及少量的Rib和GlcA组成的典型杂多糖。FBTPS在25-400 μg/mL的浓度范围内对L-02细胞没有显著的细胞毒性。与Vc相比,FBTPS对DPPH自由基的清除清率在50%以上,对超氧阴离子自由基的清除清率在85%以上,对ABTS自由基的清除清率接近100%,并且FBTPS能显著改善H2O2诱导的PC12细胞氧化损伤。综合来看,FBTPS可以作为安全的天然抗氧化剂。3、FBTPS的体外模拟消化过程本节采用体外模拟消化体系,研究了 FBTPS在口腔、胃和小肠中的消化特性。结果显示唾液、胃液和小肠液对FBTPS相对分子质量均没有显著影响,并且消化液中还原糖含量在消化前后均没有显著改变,表明口腔、胃和小肠对FBTPS均没有消化作用。同时消化液单糖组成在消化前后均没有显著变化,说明消化过程中均没有产生游离的单糖。综合来看,FBTPS在消化系统中不会被消化从而可以顺利到达大肠。这些结果能为FBTPS及其他膳食多糖的体外消化提供一些有用信息。4、FBTPS的体外肠道微生物厌氧酵解及对肠道微生物的影响本研究采用体外厌氧发酵模型和高通量测序技术研究了肠道微生物在体外对FBTPS代谢作用及FBTPS对肠道微生物影响。结果显示FBTPS分子量在HPLC中的响应值随着发酵时间的增加而逐渐降低,同时发酵液中的还原糖和多糖的含量也逐渐降低,在发酵24 h后发酵液中多糖的含量降低了 75.9%,结果表明不可消化的FBTPS进入大肠后可以被肠道微生物水解和利用。同时聚类分析和主成分分析均表明FBTPS可以改变肠道微生物的结构和组成,FBTPS可以显著降低Firmicutes/Bacteroidetes的比例,同时在属的水平上显著增加Bacteroides和Prevotella的相对丰度。随着发酵时间的增加,FBTPS可以逐渐降低发酵液的pH值,同时短链脂肪酸的含量从3.46±0.17增加到48.22±3.56 mM,其中乙酸、乳酸和丙酸的含量明显增加,正丁酸、异丁酸、正戊酸和异戊酸没有显著变化。综合来看FBTPS对肠道微生态具有一定的调节作用。5、FBTPS调节小鼠高脂饮食诱导的MS和肠道菌群紊乱本节以高脂膳食持续喂养C57BL/6J小鼠诱导MS模型,同时给予高脂饮食小鼠不同剂量(200、400和800 mg/kg/day)的FBTPS干预从而评价FBTPS对MS和肠道微生物的影响。小鼠生理生化分析显示FBTPS可以显著抑制高脂膳食诱导的体重增加、脂肪组织的积累、脂肪细胞的大小、肝脏重量、肝脏脂质沉积及血清中TC和LDL-C水平,结果表明FBTPS对小鼠高脂膳食诱导的MS具有显著的抑制作用并呈现明显的剂量依赖性。通过定量PCR分析发现FBTPS可以降低小鼠肝脏中LXRα、FAS、SREBP-1c和PPARγ脂肪合成、积累相关基因的表达,并增加CPT-1脂肪酸氧化、分解代谢相关基因的表达从而调节高脂膳食导致的MS。高通量测序结果表明FBTPS干预可以显著调节高脂膳食小鼠肠道微生物的多样性和菌群的整体结构,中剂量和高剂量FBTPS干预后的小鼠与正常膳食小鼠具有相似肠道微生物组成。在科的水平FBTPS显著降低肠道中 Erysipelotichaceae、Coriobacteriaceae 和 Streptococcaceae 的相对丰度,并且FBTPS对肠道微生物的调节也均表现出剂量依赖性。在OTUs水平,HFD膳食显著改变的95个OTUs中有33、31和36个OTUs分别被低剂量、中剂量和高剂量的FBTPS干预缓解回来,FBTPS一共可以显著恢复55个高脂膳食改变的OTUs。其中Spearman分析表明有50个OTUs与小鼠的MS成显著的正相关或者负相关。其中FBTPS可显著提高23个与MS呈负相关的OTUs的相对丰度并降低27个与MS呈正相关的OTUs的相对丰度。尽管本研究难以得到FBTPS调节肠道微生物与缓解代谢综合征的因果关系,但我们的结果表明FBTPS调节肠道微生物与缓解高脂膳食小鼠的MS呈显著的相关性,并且肠道菌群的变化可能是FBTPS介导的有益的代谢作用重要机制。综合来看,FBTPS调节高脂膳食小鼠MS的机理可能是不可消化的FBTPS顺利到达大肠并通过调节肠道微生物进而调节宿主脂代谢从而预防高脂膳食导致的小鼠MS。但具体的准确机制还需要进一步研究。