虽然聚合酶链式反应(PCR)技术已被广泛地用于大量生物医学研究,但是PCR过程中常见的非特异性扩增反应,一直是该技术的一个难点,严重影响了PCR的效果,特别是在多重PCR实验中,由于多个引物与模板DNA在一个试管中反应,更容易造成引物与模板的非特异性结合。然而,一直以来多重PCR引物设计被认为是一个NP-完全问题,即只能给出一个近似的算法来得到算法上的最优解,如:基于遗传算法为多重PCR设计最优的引物组合的方案等。归纳起来,针对多序列DNA模板的PCR引物设计,要么是设计多引物,要么是设计兼并引物,无论是哪种方式,虽然影响多重PCR实验结果的外在因素繁多而复杂,但针对物种的基因组和转录组范围内的引物特异性筛查是确保多重PCR实验成功的关键之一,而目前该领域尚缺乏一个有效的工具来设计、评估、筛选引物。本文首先针对PCR中可能出现的非特异性扩增,为了最大限度地降低非特异性产物的出现率,同时避免用户频繁使用Blast比对检查非特异性,对PCR实验前的引物进行特异性评估,开发了基于NCBI-Blast的引物评估和模板DNA特异性结合能力评估的,常用物种基因组和转录组数据库的引物特异性评估系统(PSC),并基于虚拟PCR实验确定了用于引物质量核查计算的多种参数,能够在线提供多个物种的引物特异性核查结果。该系统可以有效地对引物序列可能产生的所有非特异性扩增进行预测,有助于实验前引物优化或者对非特异扩增结果进行解释,最终达到提高PCR效率的目的。依据反馈意见,PSC系统由简单的基于单因素(序列相似性)的PCR评估系统,升级为基于多因素(序列相似性,引物3’端稳定性,Tm值,PCR反应离子浓度等)的引物特异性评估系统(MFEprimer),使之更为科学合理,贴近实验,论文发表后,该系统受到国际认可。在成功开发了引物特异性评估系统MFEprimer后,我们在此基础上结合业界公认的Primer3引物设计软件,开发出了适合于多重PCR特异性引物组合设计的系统(MPprimer),可显著减少多重PCR实验中因引物组合设计的不合理而出现非特异性扩增条带的现象,提高了多重PCR实验的可靠性,并为实验人员提供了在线的虚拟电泳图模拟功能,使得多重PCR引物设计结果显现更为直观。通过分别对小鼠五个基因(beta-actin,B2m,Pgkl,GAPDH,Rpl13a)和线虫四个基因(F21A3.6,C26C6.7,act-1,R13A1.8)进行多重PCR实验验证,结果显示MPprimer所设计的引物组合效果良好,能较好地满足多重PCR实验的验证需求,避免非特异性条带的出现,为多重PCR引物设计领域提供了又一个简洁方便实效的引物特异组合设计工具。