研究背景：蚊虫可传播许多严重的人类疾病，其中，疟疾更是目前世界上最普遍也是最致命的疾病之一，每年全球约有5亿人被疟疾感染，估计死亡人数有270万，是WHO公布的“十大重点防治的疾病”之一，2005年我国报告疟疾发病42319例，发病率为0.59/万。由于对疟疾缺乏有效的疫苗，一直以来对疟疾的预防主要是通过蚊媒的控制来阻断其传播。DTT、溴氰菊酯等化学杀虫剂的研制成功曾经给蚊媒病的防治带来一线曙光，但随着蚊虫抗药性的产生，这个幻想又破灭了。而疟原虫耐药性的出现意味着控制蚊媒再一次成为最有效且实用的减轻疟疾负担的方法，但研制新化学药物所需费用昂贵及使用杀虫剂对环境造成污染等方面的问题，迫使人们去寻找新的途径来控制蚊媒。现代分子生物学和转基因技术的迅猛发展给疟疾的防治带来了新的方法：这种方法主要是通过转基因技术将一些效应分子基因插入到蚊虫的基因组中，然后在特异启动子驱动下大量高效表达，从而起到影响疟原虫生长发育甚至将其杀死的作用。 疟原虫抗性转基因蚊的研究经历了二十几年的发展，如今已经形成了一套比较成熟的技术手段，如有效的转化和转染体系、合适的报告基因、有效的组织与时期特异性启动子和有效的基因导入方法等。在这些技术支持的基础上，需要选择合适的效应分子，使之在基因修饰蚊虫体内有效表达并发挥抗疟作用。根据疟原虫的生活史，动合子期是疟原虫在蚊体内发育的最薄弱环节，因此，选择这个时期作为靶标对其进行攻击具有明显的优势。Pfs25是恶性疟原虫动合子期表达的一种最主要的表面抗原，研究显示，抗Pfs25的单链抗体487能明显阻断蚊体内疟原虫动合子发育成卵囊。本课题组欲尝试以单链抗体487作为效应分子构建疟原虫抗性转基因蚊，然而先前的实验发现，487在转基因蚊体内的表达效果并不理想。因此我们尝试对487的编码基因进行改造，在不改变其编码的氨基酸序列基础上，根据宿主(按蚊)的密码子偏嗜情况对487基因的碱基序列进行修改，并将修改后的487基因(m487)与按蚊本身的免疫效应分子CecropinA基因连接，构建融合基因Cep&m487；然后将Cep&m487基因序列克隆入pET32a(+)载体中进行原核表达，初步鉴定其体外生物活性；并把Cep&m487基因连接入带有眼特异性启动子(3x3p)驱动的红色荧光蛋白(DsRed)作为筛选标志物、冈比亚按蚊羧肽酶(Anophelesgambiaecarboxypeptidase，AgCP)启动子及piggyBac转座元件的重组转化载体，用显微注射的方法将其注入新鲜蚊卵中用以观察其转化效果。 目的： 1.改造抗恶性疟原虫Pfs25单链抗体487的编码基因； 2.原核表达改造后的融合基因Cep&m487，并对表达的重组蛋白进行初步的体外生物学活性鉴定； 3.构建由眼异性性启动子(3x3p)驱动的红色荧光蛋白(DsRed)作为筛选标志物、AgCP启动子驱动的抗疟原虫动合子抗体基因及具有高度特异性转座元件piggyBac组成的重组转化载体质粒pBac-AgCP-Cep&m487； 4.用显微注射的方法将重组载体质粒pBac-AgCP-Cep&m487注入新鲜蚊卵中并观察其转化效果。 方法： 1.比较冈比亚按蚊和小鼠的密码子使用频率，将鼠源性487基因中按蚊的稀有密码子替换成按蚊偏好的密码子； 2.将按蚊本身的免疫效应分子CecropinA基因与修改后的487连接，构建并合成融合基因Cep&m487。 3.设计引物扩增Cep&m487，利用酶切、连接反应构建pET32a(+)-Cep&m487重组质粒，并进行PCR酶切鉴定和测序分析； 4.将重组质粒pET32a(+)-Cep&m487转入BL21(DE3)中，IPTG诱导表达并对表达的重组蛋白进行纯化； 5.WesternBlot分析重组蛋白的免疫反应性； 6.琼脂糖扩散法初步检测重组蛋白的体外抑菌活性。 7.设计酶切位点，通过酶切，连接等方法，将融合基因Cep&m487经穿梭质粒pSlfal180fa连接到AgCP启动子下游，然后将AgCP-Cep&m487克隆入转移载体pBac[3x3p-DsRedafm]，构建重组转化载体质粒pBac-AgCP-Cep&m487。 8.运用显微注射技术将重组转化载体质粒pBac-AgCP-Cep&m487注入新鲜的蚊卵； 9.对孵化出的幼虫进行转化效果的初步分析。 结果： 1.成功对鼠源性抗恶性疟原虫Pfs25单链抗体487的编码基因进行了改造。 2.成功构建重组表达质粒pET32(+)-Cep&m487，通过IPTG诱导后，重组蛋白主要以包涵体形式高效表达，WesternBlot结果显示重组蛋白与抗6-his-tag抗体具有特异的免疫反应性；琼脂糖扩散法显示重组蛋白无体外抑菌活性。 3.构建出由眼异性性启动子(3x3p)驱动的红色荧光蛋白(DsRed)作为筛选标志物、AgCP启动子驱动的抗疟原虫动合子抗体基因及具有高度特异性转座元件piggyBac组成的重组转化载体质粒pBac-AgCP-Cep&m487。 4.微注射了1000只蚊卵，孵化率达5％，荧光显微镜下没有观察到表面筛选标记阳性(红色眼)的个体。 结论： 1.构建了融合的抗恶性疟原虫动合子抗体基因Cep&m487； 2.该基因在E.coli中高效表达，表达的重组蛋白与抗6-his-tag抗体具有特异的免疫反应性，重组蛋白纯化后不显示体外抑菌活性； 3.构建出由眼特异性启动子(3x3p)驱动的红色荧光蛋白(DsRed)作为筛选标志物、AgCP启动子驱动的抗疟原虫动合子抗体基因及具有高度特异性转座元件piggyBac成的重组转化载体质粒pBac-AgCP-Cep&m487，该质粒可用于后续的转基因抗疟蚊构建的研究。