载脂蛋白D作为一种糖蛋白,主要存在于血液中的高密度脂蛋白（HDL）,同时广泛分布于各组织中。载脂蛋白D主要作为脂类,固醇类物质的转运体,同时还参与中枢神经系统和周围神经系统的修复,免疫系统反应,抵抗外界压力信号,改变运动能力以及参与一些神经退行性疾病。载脂蛋白D广泛存在于不同物种中,通过由八个反向平行的β折叠形成的L-型桶状结构与一些疏水性的小分子结合,运输到靶组织,参与调控组织的发育等生理功能。载脂蛋白D在人类,小鼠,以及果蝇中有着深入的研究,然而在家蚕中研究却鲜有报道。作为一种重要的鳞翅目经济性昆虫的家蚕,一直以来受到广泛的关注。同时家蚕在发育过程中伴随着巨大形态学和功能学的变化。利用蛋白质组学技术,我们从家蚕蛹后期鉴定出了两个具有lipocalin结构域的载脂蛋白D（Apolipoprotein D）基因,在SilkDB编号为BGIBMGA002703,BGIBMGA002704。本研究主要通过生物信息学分析、基因克隆、原核表达、Western Blot技术、免疫组化、荧光定量PCR等方法鉴定到家蚕的两个载脂蛋白D蛋白,编号为BGIBMGA002703,BGIBMGA002704基因（ApoDⅠ和ApoDⅡ）,并对其进行了克隆表达及抗体的制备研究,对其组织和时期表达特征进行探究及组织定位分析,同时对其功能进行了初步探究。主要研究结果如下:1、家蚕载脂蛋白D（ApoDⅠ、ApoDⅡ）的鉴定及生物信息学分析;通过对家蚕蛹后期的蜕皮液和血液的双向电泳分析,鉴定到了在SilkDB上编号为BGIBMGA002703,BGIBMGA002704的两个基因,基因定位于家蚕大造种的第五号染色体上,具体位置分别为nscaf2529:4191766..4194594（+strand）和nscaf2529:4202485..4205359（+strand）。芯片数据和RT-PCR显示,ApoDⅠ主要在家蚕的头部和精巢表达,ApoDⅡ主要在家蚕的头部和中部及后部丝腺表达。基因组结构显示它们都具有4个外显子和3个内含子,结构域预测结果显示apodⅠ具有一个lipocalin（pf00061）结构域,apodⅡ具有一个lipocalin₂（pf08212）结构域。两者氨基酸序列比对具有24.65%的相似性。对apodⅠ和apodⅡ基因进行序列分析发现,它们都具有信号肽序列。同时对两个基因的编码的蛋白的三级结构预测显示,都能形成一个由八个反向平行的β折叠形成的l-型桶状结构。进化关系显示家蚕的apodⅠ基因与美国白蛾的载脂蛋白d基因进化关系较近,apodⅡ基因与内华达白蚁载脂蛋白d基因的进化关系较近。利用silkdb进行多序列比对,鉴定出家蚕中9个lipocalin家族基因,共聚为三类,第一类主要在中肠特异表达,第二类主要在丝腺表达,第三类广泛的在生殖腺,马氏管,脂肪体,头和血淋巴中表达。2、家蚕载脂蛋白d基因的原核表达、纯化和抗体制备;通过对apodⅠ和apodⅡ基因的序列分析,设计不包含信号肽序列的表达引物。以蛹两天的cdna为模板进行pcr扩增,将获得的片段插入到p28（pet-28a改造）载体上,测序成功后转化到transetta（de3）表达菌株内,发现apodⅠ和apodⅡ都以包涵体的形式表达。纯化apodⅡ的包涵体,制备抗体。为获得可溶性的蛋白,又构建了pet-sumo-apodⅠ和pet-sumo-apodⅡ两个原核表达载体,测序正确后,转化入transetta（de3）表达菌株内,在上清中获得了sumo-apodⅠ和sumo-apodⅡ两个重组蛋白。3、家蚕载脂蛋白d的组织及时空表达分析及免疫组化;利用rt-pcr对五龄第3天家蚕各组织检测,发现apodⅠ基因主要在头部和精巢表达,apodⅡ基因主要在家蚕头部和丝腺表达。利用rt-pcr和q-pcr对五龄到蛹发育时期整蚕的核酸水平检测,发现apodⅠ基因主要在蛹期表达,其中在化蛹第3天表达量达到最高。apodⅡ基因在蛹前期及蛹后期、蛾期有高量表达。利用westernblot技术对apodⅡ蛋白水平的表达检测发现,apodⅡ蛋白主要存在家蚕五龄3天的头部,脂肪体,生殖腺,以及中部和后部丝腺中。对家蚕五龄到蛹期的时期血液检测发现,apodⅡ主要存在于上簇及蛹后期的血液中。对蛹期的头和卵巢的检测发现,在头中apodⅡ主要在蛹6天高量表达,卵巢中apodⅡ主要在蛹后期及蛾期有高表达。利用免疫荧光技术对载脂蛋白d（apodⅡ）进行组织定位,发现apodⅡ在家蚕五龄3天的精巢,卵巢,上簇时期的脑,化蛾当天的复眼中检测到了信号。4、家蚕载脂蛋白d基因对压力应激和细菌侵染的响应及调控初探选取uv和h2o2作为外界压力信号,大肠杆菌和沙雷氏菌作为细菌侵染的菌株,处理家蚕,通过q-pcr检测发现,apodⅠ和apodⅡ基因通过上调表达来响应外界压力信号,同时在细菌侵染实验中,ApoDⅠ和ApoDⅡ基因也以上调的方式来响应外界细菌侵染。为进一步解释可能调控方式,我们选取ApoDⅡ基因的5`上游1500bp的启动子序列,通过分析和结合文献,我们发现了与压力信号相关的参与DNA损伤修复的转录因子结合位点以及参与免疫活动相关的转录因子结合位点。通过在ApoDⅡ基因启动子区域发现大量BRC结合位点,通过蜕皮激素处理BmE细胞6小时后检测发现,ApoDⅡ基因的表达量显著上调,推测ApoDⅡ基因可能与蜕皮激素调控相关。