在我国乙肝高发，若得不到有效控制，终将进展为肝纤维化，甚至肝硬化。肝硬化失代偿期患者的5年病死率高达70%-86%。然而，目前肝硬化的病理生理机制还未完全清楚，临床上缺乏有效的抗纤维化药物。因此，探讨肝硬化的发生机理，寻求有效的干预方法迫在眉睫。肝脏、脾脏及骨髓等网状内皮系统是体内主要的储铁器官。近年来，多项研究显示慢性肝病，如非酒精性脂肪肝、肝硬化及肝癌等，存在肝内铁代谢紊乱。肝内铁过度沉积参与了肝脏疾病的发生发展，提示铁在肝脏疾病中的重要作用。Fe2+是血红素氧合酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)的降解产物之一，在肝硬化时HO-1表达上调，Fe2+生成增多，可能参与肝硬化及其并发症形成的病理生理过程。我们前期实验证实，HO-CO系统在肝纤维到肝硬化不同阶段，不同并发症及不同脏器发挥的作用不同。目前，国内外主要研究HO-1的抗氧化、抗炎及抗凋亡等作用机制，而关于其产物Fe2+、CO及胆绿素在疾病中发挥的作用研究较少。此外，铁在肝硬化发生发展中的作用机制目前还未清楚。临床上，肝硬化晚期上消化道出血患者，大量多次输注陈旧红细胞可能导致肝内铁沉积；肝硬化晚期脾大脾功能亢进，大量红细胞被破坏并释放过多铁，而且肝脏是重要的储铁器官。本研究通过高铁、去铁、脾切除、诱导或抑制HO-1表达来调节肝内铁代谢，揭示铁在肝硬化发生发展中的作用机制，为治疗肝硬化提供新的观点和思路。本研究共分三部分第一部分干预肝内铁代谢对大鼠肝硬化影响的研究第二部分诱导或抑制血红素氧合酶-1表达对肝硬化大鼠肝内铁代谢影响机制的研究第三部分脾切除对肝硬化肝内铁代谢及门脉高压影响的研究第一部分干预肝内铁代谢对大鼠肝硬化影响的研究目的：通过给铁或去铁干预肝硬化大鼠肝内铁代谢，进一步研究铁在肝硬化发生发展中的作用。方法：成年健康雄性Sprague-Dawley大鼠44只，随机分成4组：假手术(Sham)组10只、肝硬化(bile duct ligation，BDL)组10只、高铁(Fe)组14只，去铁胺(deferoxamine，DFX)组10只。大鼠肝硬化模型采用胆总管结扎的方法制备，4周后造模成功并取材。Fe组和DFX组制模方法同BDL组，从造模第一天开始，分别给予腹腔注射右旋糖酐铁40mg/mL/kg体重，甲磺酸去铁胺20mg/mL/kg体重，3次/周，BDL组给予等量的生理盐水腹腔注射。4周后，所有大鼠采集静脉血之后处死，采用全自动生化分析仪检测血清丙氨酸氨基转移酶(alanineaminotransferase，ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase，AST)、总胆红素(total bilirubin，TBIL)反映肝脏功能；取肝组织，HE染色观察肝脏的结构改变；测定血清铁、血清铁蛋白的含量，原子分光光度计法测定肝内铁含量(Liveriron content，LIC)，采用普鲁士蓝染色观察肝脏铁沉积的分布情况。免疫组织化学检测α肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)的表达及分布；Western-blot方法测定肝内转录生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)、α-SMA；RT-PCR的方法检测大鼠肝脏TGF-β1、α-SMA mRNA的水平，采用试剂盒测定肝组织内羟脯氨酸(hydroxyproline，HYP)的含量和肝组织丙二醛(malonaldehyde，MDA)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)的活性。结果：4w后BDL大鼠模型成功，胆总管扩张明显。血清生化指标测定结果显示：与Sham组相比，BDL组AST、ALT及TBIL均明显升高(P <0.01)；与BDL组相比，Fe组进一步升高，而DFX组则明显降低(P <0.01)。HE染色显示，BDL组肝脏细胞坏死，炎性细胞浸润，纤维间隔形成，肝细胞结节样再生，假小叶形成；Fe组肝细胞片状坏死，纤维增生较多，而DFX组肝细胞较少坏死，纤维增生少，无明显的假小叶形成。与Sham组相比，BDL组血清铁、血清铁蛋白及肝内铁均显著增加(229.74±9.72μg/dL vs165.4±10.79μg/dL，P <0.01；45.94±0.52μg/L vs39.42±0.38μg/L，P <0.01；440.74±12.58μg/g vs350.15±16.4μg/g，P <0.01)；与BDL组相比，Fe组三者均明显升高(378.92±35.59μg/dL vs229.74±9.72μg/dL，P <0.01；53.12±0.65μg/L vs45.94±0.52μg/L，P <0.01；593.55±6.66μg/g vs440.74±12.58μg/g，P <0.01)，而DFX组则明显降低(181.63±4.34μg/dL vs229.74±9.72μg/dL，P <0.01；42.54±0.33μg/L vs45.94±0.52μg/L，P <0.01；361.55±21.24μg/g vs440.74±12.58μg/g，P <0.01)。与Sham组相比，BDL组大鼠肝内TGF-β1及α-SMA蛋白及mRNA表达水平均明显升高(P <0.01)；Fe组TGF-β1及α-SMA表达水平则较BDL组均明显增加(P<0.01)，DFX组TGF-β1及α-SMA表达水平则明显减少(P <0.01)。α-SMA免疫组化结果与其蛋白及基因一致。与Sham组相比，在BDL组肝内SOD水平明显降低(P <0.01)，而MDA水平明显升高(P <0.01)；与BDL组相比，Fe组SOD进一步降低(P <0.01)，而MDA则升高明显(P <0.01)；与BDL组相比，而DFX组SOD明显升高(P <0.01)，MDA则明显降低(P <0.01)。结论：本研究发现胆汁淤积性肝硬化肝内有少量铁沉积。肝内过度铁沉积可以加重肝硬化，而去铁治疗能减少肝内铁沉积，延缓肝硬化。第二部分诱导或抑制血红素氧合酶-1表达对肝硬化大鼠肝内铁代谢影响机制的研究目的：通过诱导或抑制血红素氧合酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)表达，调节其产物铁在肝硬化大鼠肝内的代谢，进一步研究HO-1及铁对肝硬化的影响。方法：成年健康雄性Sprague-Dawley大鼠42只，随机分成4组：假手术(Sham)组8只、肝硬化(bile duct ligation，BDL)组10只、锌原卟啉(zinc protoporphyrin，ZnPP)组12只，钴原卟啉(cobalt protoporphyrin，CoPP)组12只。大鼠肝硬化模型采用胆总管结扎的方法制备，4周后造模成功并取材。CoPP组和ZnPP组制模方法同BDL组，从造模第一天开始，分别给予腹腔注射CoPP或ZnPP5mg/kg体重，3次/周，BDL组给予等量的生理盐水腹腔注射。4周后所有大鼠采血后处死。采用全自动生化分析仪检测血清丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase，AST)、总胆红素(total bilirubin，TBIL)及血清铁；采用原子分光光度计法测定肝内铁含量(Liver iron content，LIC)，采用普鲁士蓝染色观察肝脏铁沉积的分布情况； HE染色观察肝脏的结构改变，通过免疫组织化学的方法观察大鼠肝脏HO-1蛋白的表达及分布；Western-blot方法测定肝内HO-1蛋白的表达，核转录因子Nrf2(nuclear factor-E2-related factor2，Nrf2)；RT-PCR的方法检测大鼠肝脏HO-1及Nrf2mRNA的水平。采用ELISA方法测定大鼠血清转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)及海帕西啶(Hepcidin)；测定肝组织丙二醛(malonaldehyde，MDA)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)的活性。结果：血清生化指标AST、ALT及TBIL测定结果显示：与Sham组相比，BDL组明显升高(P <0.01)；与BDL组相比，CoPP组进一步升高(P <0.01)，而ZnPP组则明显降低(P <0.01)。肝脏HE染色显示BDL组大鼠肝脏细胞坏死，肝小叶结构被破坏，汇管区可见大量炎性细胞浸润，纤维间隔形成，肝细胞结节样再生，假小叶形成；CoPP组纤维化评分较BDL增加(P <0.01)，而ZnPP组评分较低(P <0.01)。VG染色显示BDL组肝内I型胶原沉积较Sham组明显增多(P <0.01)，与BDL组相比，CoPP组I型胶原沉有所增加(P <0.01)，而ZnPP组胶原沉积明显减少(P <0.01)。与Sham组相比，BDL组血清TGF-β1浓度明显升高(P <0.01)；与BDL组相比，CoPP组TGF-β1浓度明显增加(P <0.01)，而ZnPP组明显降低(P <0.01)。血浆Hepcidin浓度在BDL组较Sham组明显降低(292.35±11.81ng/mlvs366.71±4.66ng/ml，P <0.01)；与BDL组相比，CoPP组血浆Hepcidin浓度减低更明显(275.73±10.13ng/ml vs292.35±11.81ng/ml，P <0.01)，而ZnPP组浓度明显升高(315.79±12.0ng/ml vs292.35±11.81ng/ml，P <0.01)。HO-1及Nrf2蛋白及基因检测表明：与Sham组相比，BDL组大鼠肝内HO-1的蛋白及mRNA的水平明显升高(P <0.01)；CoPP组HO-1水平较BDL组明显增加(P <0.01)，ZnPP组HO-1表达水平则明显减少(P <0.01)。HO-1免疫组化结果与其蛋白及基因一致。血清铁浓度及LIC在BDL组较Sham组升高(229.74±9.72μg/dl vs165.4±10.8μg/dl，P <0.01)；与BDL组相比，二者在CoPP组则明显升高(2272.14±16.28μg/dlvs229.74±9.7μg/dl， P <0.01)，而在ZnPP组明显下降(194.95±4.72μg/dlvs229.74±9.72μg/dl，P <0.01)。与Sham组相比，在BDL组SOD水平明显降低(P <0.01)，而MDA水平明显升高(P <0.01)；与BDL组相比，CoPP组SOD进一步降低(P <0.01)，而MDA则升高明显(P <0.01)；与BDL组相比，而ZnPP组SOD明显升高(P <0.01)，MDA则明显降低(P <0.01)。结论：ZnPP抑制HO-1表达能减少BDL诱导的肝硬化大鼠肝内铁沉积，减轻肝纤维化。Nrf2/Keap1通路可能参与了HO-1表达及铁沉积。第三部分脾切除对肝硬化肝内铁代谢及门脉高压影响的研究目的：探讨脾切除对肝硬化门脉高压大鼠血红素氧合酶/一氧化碳系统(Hemeoxygenase/carbon monoxide, HO/CO)及肝内铁代谢的影响，进一步研究脾切除治疗肝硬化的机制。方法：成年健康雄性Sprague-Dawley大鼠32只，随机分成3组：假手术(Sham)组10只、肝硬化(bile duct ligation，BDL)组10只和脾切除(Splenectomy)组12只。大鼠肝硬化模型采用胆总管结扎的方法制备，2周时Splenectomy组行脾切除。4周后，所有大鼠以生物机能实验仪测定门静脉压力，采集静脉血，采用全自动生化分析仪检测血清丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase，AST)、总胆红素(total bilirubin，TBIL)及血清铁，采动脉血测定碳氧血红蛋白(carboxyhemoglobin，COHb)；机能实验仪测定大鼠门静脉压力(portal vein pressure，PVP)；取肝脾组织，HE染色观察肝脏的结构改变，VG染色观察脾脏I型胶原含量；原子分光光度计法测定肝内铁含量(Liveriron content，LIC)，采用普鲁士蓝染色观察肝脾铁沉积的分布情况。ELIAS方法检测血清中转录生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)水平；Western-blot方法测定肝内HO-1蛋白表达；RT-PCR的方法检测肝内HO-1、基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)和基质金属蛋白酶抑制剂-1(tissueinhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1) mRNA的表达水平，测定肝组织内羟脯氨酸(hydroxyproline，HYP)的含量。测定肝组织丙二醛(malonaldehyde，MDA)和谷胱甘肽(glutathione，GSH)的活性。结果：2w脾脏明显增大，4w后BDL组肝硬化造模成功。与Sham组相比，BDL组AST、ALT及TBIL均明显升高(P <0.01)，Splenectomy组三者则较BDL组明显降低(P <0.01)。肝脏组织病理学证实脾切除能明显减少肝内纤维间隔形成，减少胶原沉积。与BDL组比较，Splenectomy组HYP明显降低(153.2±12.4μg/g vs173.4±18.4μg/g，P <0.01)，血清TGF-β1明显减少(4.6±0.28ng/ml vs9.86±0.72ng/mL，P <0.01)，PVP明显降低(10.31±0.98mmHg vs15.81±1.66mmHg，P <0.01)。BDL组肝内HO-1mRNA和蛋白的水平较Sham组升高(P <0.01)；与BDL组相比，Splenectomy组肝内HO-1mRNA和蛋白的水平明显降低(P <0.01)。血COHb水平与HO-1表达水平一致。肝脏HO-1免疫组化显示，HO-1主要在肝细胞及中央静脉周围表达。脾脏HO-1免疫组化显示，HO-1主要表达在脾脏红髓，与Sham组比较，BDL组HO-1表达增加(P <0.01)，Splenectomy组2w的脾脏HO-1表达较BDL组减少(P <0.01)。与Sham组相比，BDL组大鼠血清铁、肝内铁均明显升高(231.91±7.7μg/dL vs164.87±15.6μg/dL，P <0.01)；而Splenectomy组则较BDL组二者明显降低(185.15±22.3μg/dL vs231.91±7.7μg/dL，P <0.01)。普鲁士蓝染色显示，肝内铁主要沉积在巨噬细胞等。脾脏铁沉积主要在红髓。VG染色显示2w和4w脾脏都有明显的I型胶原沉积。与Sham组相比，BDL组肝内MMP-2及TIMP-1mRNA水平均明显升高(P <0.01)；而Splenectomy组二者则较BDL组二者明显减少(P <0.01)。与Sham组相比，BDL组肝内MDA水平明显升高(P <0.01)，GSH水平明显减少(P <0.01)；与BDL组相比，Splenectomy组肝内MDA水平明显降低(P <0.01)，而GSH水平明显升高(P <0.01)。结论：脾切除可能调节HO/CO系统，通过减少HO-1及CO的表达降低PVP，进一步改善肝功能。