论文部分内容阅读
随着近年来生物技术的快速发展,动物克隆研究的重点已经从单纯的体细胞克隆向体细胞转基因与核移植技术相结合转移。要获得转基因动物,对于作为核供体的转基因体细胞有着很高的要求。通常体细胞在体外易发生衰老,很难经受转染及之后高强度,长周期的药物筛选。这种情况下,获得能在体外传代较多,并保持良好形态及较强增殖能力的供体细胞就显得十分必要。虽然现已建立起了一些物种的成体成纤维细胞系,但胎儿成纤维细胞由于体外培养生长速度快,染色体倍性稳定等特点,已经成为了公认的,更为理想的体细胞克隆和转基因核移植的供体。既便如此,胎儿成纤维细胞的利用依旧面临着取材较为困难,转染后筛选时细胞损伤大,传代细胞容易衰老,扩大培养难等问题。而通过各种技术和方法获得稳定传代和有较强增殖能力的胎儿成纤维细胞,就成为了研究人员正在努力为此寻找的解决途径。本实验将携带有人端粒酶逆转录酶(human Telomerase Reverse Transcriptase,hTERT)基因的质粒载体pCI-neo-hTERT通过阳离子脂质体转入山羊胎儿成纤维细胞,观察了hTERT对山羊胎儿成纤维细胞的影响,为下一步对该细胞进行二次转基因后核移植,或者直接作为供体进行核移植,以期获得稳定的重组胚融合率以及发育率,最终生产转基因克隆动物奠定一定的基础。1.用含10%血清DMEM培养液培养山羊胎儿成纤维细胞,通过脂质体LipofactamineTM 2000 Reagent将外源的人端粒酶逆转录酶基因hTERT转入山羊胎成纤维细胞,用600μg/mL G418筛选获得阳性克隆,14 d后将G418的浓度降为200μg /mL继续培养,使阳性克隆得到扩增。2.提取转染第50代阳性细胞的RNA,设计特异性引物进行RT-PCR反应。反应产物经琼脂糖凝胶电泳分析,在384 bp处出现hTERT特异性目的条带,而未转染的第30代对照组细胞无目的条带出现。3.对转染阳性细胞进行倍性分析,结果显示阳性第50代细胞为正常的二倍体。4.对转染阳性细胞进行周期分析,结果显示阳性第50代细胞较未转染第30代细胞有较高的S期,说明该细胞DNA合成旺盛,具有很强的增殖能力。5.在细胞凋亡检测中发现,未转染山羊胎儿成纤维细胞在第30代细胞凋亡率达17.9%,而转染阳性第50代细胞的凋亡率仅为7.2%,从另一个角度说明转基因阳性细胞的正常衰老得到了一定程度的控制。