研究背景胃癌是严重影响中国人民健康的重大疾病。由于诊断方法的限制,使得许多胃癌患者进展到晚期才被确诊,手术切除及化疗药物的治疗效果不理想,晚期胃癌患者预后不良。因此,揭示胃恶性转化机制是实现早期干预胃癌发生的重要科学问题。幽门螺杆菌是一级致癌因子。幽门螺杆菌感染后诱导胃部炎症和胃黏膜损伤,持续性炎症加大恶性转化风险。虽然目前幽门螺杆菌与胃癌发生的研究已有所进展,但是幽门螺杆菌促进恶性转化的机制仍需要进一步探究。本文主要研究了孤儿核受体Nurr1和组蛋白甲基转移酶SETDB1介导幽门螺杆菌相关恶性转化的调控机制。核受体家族是人体内含量最丰富的转录调节因子之一,人基因组包含48个核受体超家族,其中有大量的孤儿核受体。孤儿核受体作为转录因子以配体非依赖的方式被激活,通过调节下游基因的异常表达调控体内生理学和病理学过程。本研究中,我们分析了多种核受体基因在临床标本中的表达,发现孤儿核受体Nurr1在胃癌标本中表达上调最显著。Nurr1早期研究主要集中在其对神经元发育的调控作用机制,近些年越来越多的研究关注其在各种癌症中的作用,但Nurr1在胃癌发生过程中的作用及调控机制仍不明确。表观遗传学分子可以参与多种肿瘤的发生发展。组蛋白修饰相关酶类的抑制剂作为癌症治疗的靶向性药物已经应用于临床治疗。因此,探究胃癌发生进展过程中发挥重要作用的表观遗传学分子及其作用机制,可以为制定有效的胃癌防治策略提供理论支撑。我们通过数据库中基因表达差异分析,发现组蛋白甲基转移酶SETDB1在胃癌标本中的表达显著高于对应的癌旁组织。此外,我们分析Kaplan-Meier Plotter数据库,发现在胃癌病人中SETDB1高表达与病人不良预后相关。研究报道SETDB1属于组蛋白甲基转移酶家族,它在早期胚胎发育及胚胎干细胞生长和增殖调控中发挥重要作用。SETDB1异常表达可以促进多种癌症的发生进展,因此被认为是多种肿瘤潜在的治疗靶点。然而SETDB1在幽门螺杆菌相关胃癌发生发展中的功能及调控机制仍未完全阐明。研究目的(一)解析孤儿核受体Nurr1在幽门螺杆菌相关胃癌发生中的作用机制。(二)解析组蛋白甲基转移酶SETDB1促进幽门螺杆菌相关胃癌发生发展的调控机制。方法和结果(一)孤儿核受体Nurr1通过促进细胞周期调控分子CDK4的转录加速胃癌细胞的异常增殖;幽门螺杆菌感染可通过PI3K/AKT信号通路增加转录因子SP1的表达;SP1可结合于Nurr1的启动子上,促进Nurr1的转录激活。1.Nurr1在胃癌组织中表达升高,其高表达提示病人预后不良通过在临床标本中进行基因差异表达分析发现,Nurr1在胃癌组织中的表达显著高于在萎缩性胃炎组织中的表达。免疫组织化学染色分析发现在胃炎到胃癌的进展过程中,Nurr1的表达逐渐升高。实时定量PCR分析发现在人的胃癌组织中,Nurr1mRNA表达显著升高。GEO 数据库(GSE30727 和 GSE54129)及 Western blot分析均发现,Nurr1在人胃癌组织中的表达明显高于癌旁组织。对三个GEO数据库(GSE51105,GSE62254,GSE14210)中胃癌病人的生存分析发现,Nurr1高表达组患者的整体生存期显著低于Nurr1低表达组患者。2.Nurr1可促进胃癌细胞增殖克隆形成及CCK8分析发现,在胃癌细胞中干扰掉Nurr1可以显著抑制胃癌细胞的增殖,过表达Nurr1则促进了胃癌细胞的增殖。我们构建了 Nurr1稳定敲除的胃癌细胞及对照组细胞,然后将其皮下注射到裸鼠背部两侧。裸鼠异种移植瘤模型显示,Nurr1干扰组小鼠肿瘤的生长速率显著降低,同时肿瘤的大小和重量均小于对照组。上述结果说明Nurr1可以促进胃癌细胞的增殖和肿瘤形成。3.Nurr1促进细胞周期调控分子CDK4的转录实时定量PCR检测在基因启动子上含有Nurr1结合位点的癌症相关基因的表达,发现Nurr1干扰后CDK4的表达受到显著抑制。Western blot实验结果显示Nurr1干扰降低了 CDK4及下游靶基因pRb的表达,而过表达Nurr1具有相反的结果。双荧光素酶和染色质免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)实验发现,Nurr1直接结合到CDK4启动子区域,激活CDK4的转录。克隆形成、CCK8实验在体外证明CDK4可以促进胃癌细胞增殖。裸鼠皮下异种移植瘤模型实验证实CDK4可以促进胃癌细胞的肿瘤形成能力。4.幽门螺杆菌感染上调Nurr1表达实时定量PCR及Western blot实验发现,幽门螺杆菌感染可以以时间和浓度依赖的方式促进Nurr1 mRNA和蛋白表达。实时定量PCR及免疫组织化学染色实验发现,Nurr1在幽门螺杆菌阳性的胃炎标本中的表达显著高于幽门螺杆菌阴性的胃炎标本。5.幽门螺杆菌可通过PI3K/AKT信号途径增加Nurr1的表达为了探究幽门螺杆菌上调Nurr1的机制,我们在胃癌细胞感染幽门螺杆菌之前加入了五种重要的信号通路抑制剂。Western blot实验结果显示,PI3K/AKT信号通路的抑制剂可显著抑制幽门螺杆菌诱导的Nurr1表达上调。RT-PCR结果与Western blot结果一致。Western blot实验发现,AKT、P-AKT及SP1的表达与Nurr1表达趋势一致。上述结果说明幽门螺杆菌感染后主要依赖PI3K/AKT信号通路上调Nurr1的表达。6.转录因子SP1直接靶向Nurr1,调控Nurr1及下游基因的表达实时定量PCR和Western blot分析发现,SP1可以正性调控Nurr1的表达。用PROMO 3.0数据库分析Nurr1启动子区域,发现其启动子区域存在三个SP1的结合位点。双荧光素酶及ChIP实验证明,Nurr1是SP1的直接靶基因。实时定量PCR和Western blot实验发现,SP1可以介导幽门螺杆菌对Nurr1及靶基因的表达调控。7.在动物体内及临床标本中均发现Nurr1表达与SP1、CDK4和Ki67的表达呈显著正相关免疫组织化学染色发现在幽门螺杆菌感染的小鼠模型中,Nurr1、SP1、CDK4、Ki67的表达均显著升高。对临床标本的表达分析发现Nurr1、SP1、CDK4、Ki67在人胃癌组织标本中的表达均高于邻近的癌旁组织。通过对上面两个免疫组织化学染色结果分析发现,Nurr1的表达与SP1、CDK4和Ki67的表达呈正相关关系。(二)SETDB1在胃癌中表达上调,其异常高表达促进了胃癌的发生和进展。机制上,SETDB1与转录因子ERG相互结合,共同富集到CCMD1和MMP9启动子区域,促进CCND1和MMP9的表达,从而介导胃癌的发生发展。在胃癌细胞中,幽门螺杆菌通过转录因子TCF4上调SETDB1的表达,TCF4结合到SETDB1的启动子区域,增强其转录活性。1.SETDB1在胃癌中表达异常升高,其高表达与胃癌病人预后不良相关为了寻找与胃癌发生密切相关的表观遗传学调控分子,我们在两个GEO数据库(GSE13911和GSE79973)中分析了胃癌及其对应的癌旁组织中基因表达情况。结果发现有五个组蛋白甲基转移酶(SETDB1,PRMT1,PRMT3,PRMT5 S,SMYD5)和一个组蛋白去甲基化酶(MINA)在胃癌组织中的表达显著高于癌旁组织。接下来我们分析了这六个基因在TCGA数据库中的表达,发现SETDB1在胃癌病人的组织中的表达显著升高。SETDB1在胃癌标本中的蛋白表达变化与前面两个数据库中的结果一致。免疫组织化学染色发现,SETDB1在慢性浅表性胃炎组织中表达较低,在萎缩性胃炎及肠上皮化生的组织中表达有中度上调,在异常增生的组织中表达进一步增加,在胃癌组织中表达剧烈增加。实时定量PCR实验发现,SETDB1 mRNA在胃癌组织中的表达明显高于萎缩性胃炎组织。在Kaplan-Meier Plotter数据库中分析发现,SETDB1高表达组的胃癌病人总体生存期较短。2.SETDB1可以促进胃癌细胞的增殖及肿瘤形成体外的克隆形成、CCK8实验证实,SETDB1可以促进胃癌细胞增殖,且不依赖于SETDB1甲基转移酶的功能。体内裸鼠皮下成瘤实验证明,SETDB1可以促进胃癌细胞的肿瘤形成能力。免疫组织化学染色结果显示,SETDB1干扰组的裸鼠肿瘤组织中Ki67的表达明显降低,表明SETDB1的干扰降低了胃癌细胞的增殖能力。3.SETDB1促进胃癌细胞的侵袭和迁移Transwell及伤口愈合实验证明,SETDB1可以促进胃癌细胞的侵袭和迁移。我们也证明了 SETDB1不依赖其甲基转移酶功能调控胃癌细胞的侵袭和迁移。为了验证SETDB1在肿瘤转移中的作用,我们将SETDB1稳定敲除的胃癌细胞及对照组细胞通过尾静脉注射到裸鼠体内。结果发现SETDB1敲除可以显著降低胃癌细胞在裸鼠肺部的转移。HE染色可以看到SETDB1敲除组小鼠肺部的淋巴结数量明显减少。4.CCND1及MMP9介导SETDB1在胃癌中的生物学功能为了探究SETDB1调控胃癌发生发展的分子学机制,我们使用实时定量PCR筛选SETDB1可能调控的增殖和转移相关的基因,发现SETDB1干扰可以显著降低CCND1及MMP9mRNA水平的表达。随后实时定量PCR及Western blot分析发现,SETDB1干扰后CCND1及MMP9的表达明显降低,而过表达SETDB1则可以促进CCND1和MMP9的表达。5.SETDB1与转录因子ERG相互结合,促进CCND1和MMP9的转录表达IP实验证明SETDB1和ERG可以相互结合。双荧光素酶实验发现,SETDB1可以增强CCMD1和MMP9的转录活性。ChIP实验证明在胃癌细胞中,SETDB1直接连接到CCND1和MMP9启动子区域,参与其转录调控。克隆形成和Transwell实验说明CCND1和MMP9是SETDB1的下游靶基因,且在胃癌中SETDB1主要依赖于CCND1和MMP9发挥生物学功能。6.转录因子TCF4可以靶向调控SETDB1的表达PROMO 3.0数据库对SETDB1的启动子区域进行分析,发现在SETDB1的启动子上存在TCF4的结合基序CAAAG。实时定量PCR和Western-blot实验证实,在胃癌细胞中,TCF4可以在mRNA及蛋白水平调节SETDB1表达。双荧光素酶实验证明,TCF4干扰抑制SETDB1启动子的荧光素酶活性,而TCF4过表达则具有相反的结果。ChIP实验发现,TCF4直接结合到SETDB1的启动子上,调控SETDB1的转录表达。7.幽门螺杆菌感染后通过TCF4上调SETDB1的表达实时定量PCR及Western blot分析证明,幽门螺杆菌感染可以促进SETDB 1 mRNA及蛋白水平的表达,且幽门螺杆菌对SETDB1的诱导呈时间和浓度依赖性。实时定量PCR实验证明,SETDB1在人幽门螺杆菌阳性的胃炎标本中的表达明显高于幽门螺杆菌阴性的胃炎标本。免疫组织化学染色显示,在人胃炎标本中SETDB1蛋白水平表达与mRNA水平表达一致。幽门螺杆菌灌胃构建的胃炎小鼠模型中,SETDB1在幽门螺杆菌感染组的小鼠胃上皮组织中的表达明显高于未感染组。通过实时定量PCR和Western blot实验证实,TCF4介导幽门螺杆菌对SETDB1表达的上调。8.SETDB1的表达与胃癌疾病进展相关免疫组织化学染色分析发现,在幽门螺杆菌感染同时加入甲基亚硝基脲(MUN)处理的小鼠中,SETDB1的表达明显增加。同时,免疫组织化学染色实验检测SETDB1在癌旁组织、胃癌组织及转移组织中的表达。结果显示SETDB1在癌旁组织中表达较少,在胃癌组织中表达增加,而在转移组织中的表达进一步升高,呈现一个随着疾病进程逐步升高的趋势。研究结论本研究我们发现孤儿核受体Nurr1及组蛋白甲基转移酶SETDB1在胃癌中表达升高,且其高表达与胃癌患者生存期较短相关。Nurr1和SETDB1可以通过转录调控影响靶基因的表达,从而促进胃癌的发生发展。同时,我们发现幽门螺杆菌感染可以上调Nurr1和SETDB1的表达。本研究发现幽门螺杆菌相关胃癌发生和进展过程中新的调控机制,提示靶向Nurr1和SETDB1调控通路对于胃癌的防治有重要的意义。