喜树碱类似物FL118诱导结肠癌细胞焦亡及抑制其生长和转移的机制研究

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目的 细胞焦亡作为一种新发现的炎症性程序性细胞死亡,目前在机制研究方面与结直肠癌的相关性研究较浅。同时,相关研究证实,FL118对结肠癌的生长和转移有显著的抑制作用,但其与细胞焦亡的关系机制尚未研究。本研究主要探讨FL118是否通过细胞焦亡影响结肠癌的抗肿瘤作用。方法 首先检测细胞焦亡基因Caspase-1在结肠癌组织中的表达情况。通过生物信息学方法分析TCGA数据库中结肠癌相关的基因数据,从而了解Caspase-1基因在结肠癌中的表达情况;应用免疫组化实验对结肠癌患者的临床样本进行分析,从而了解Caspase-1蛋白在结肠癌中的表达情况以及与结肠癌的相关性。其次,检测FL118对人结肠癌细胞(HT29和SW480)的抗肿瘤作用。应用MTT实验检测FL118对结肠癌细胞活力的影响;应用划痕和Transwell实验检测FL118对结肠癌细胞迁移和侵袭的影响。为了探索细胞焦亡在FL118发挥抗肿瘤作用中的角色,通过光学显微镜观察细胞形态学变化,进一步应用TUNEL实验证明细胞死亡的现象,辅助LDH释放实验验证细胞焦亡的发生。为了进一步在机制上验证Caspase-1介导的细胞焦亡通路对于FL118抗肿瘤的作用,通过qRT-PCR实验以及Western Blot和免疫荧光实验分别在mRNA水平和蛋白水平检测FL118对Caspase-1及下游标志基因IL-18、IL-1β表达的影响;并通过Elisa试剂盒辅助确认FL118处理的细胞上清中IL-18、IL-1β蛋白的表达情况。最后,通过使用Caspase-1的特异性抑制剂VX-765,应用MTT实验筛选出合适的作用浓度和作用时间,在此基础上,应用LDH释放实验检测VX-765对FL118作用于结肠癌打孔能力的影响;在mRNA水平上,VX-765对Caspase-1、IL-18和IL-1β表达的影响通过应用qRT-PCR实验检测;VX-765对Caspase-1及IL-18和IL-1β蛋白表达的影响通过应用Western Blot分析、免疫荧光实验检测;通过Elisa实验辅助验证VX-765对IL-18和IL-1β蛋白表达的影响;最后,我们通过划痕和Transwell实验验证VX-765对FL118作用于结肠癌的迁移和侵袭的影响。从而证明在体外水平细胞焦亡参与了FL118抑制结肠癌细胞生长和转移的作用。重要的是,我们通过皮下注射HCT116细胞构建肿瘤异体移植模型,尾静脉注射HT29细胞构建肺转移模型。实验设置三组:空白对照组、低浓度实验组(4 mg/kg/week)和高浓度实验组(8 mg/kg/week),灌胃给与不同剂量的FL118溶液,并定期测量异体移植模型小鼠体重及其瘤重变化。实验结束后,异体移植模型小鼠的肿瘤组织及各脏器(心、肝、脾、肺、肾、大脑)冰冻切片,肺转移模型小鼠的肺组织进行包埋保存,应用HE染色实验检测FL118对小鼠心、肝、脾、肺、肾、脑的形态学影响及肺表面肺结节的影响;在动物水平上,FL118对结肠癌死的影响应用TUNEL-DAPI染色实验进行检测;应用免疫组化实验检测FL118对体内结肠癌细胞焦亡相关蛋白的影响。从而在体内水平证明FL118诱导细胞焦亡抑制结肠癌的生长和转移。结果 生物信息学统计分析显示caspase-1的表达水平与结肠癌的发生成负相关性,在正常结肠样本中的表达显著高于结肠癌样本;免疫组化实验结果均显示Caspase-1蛋白在癌旁组织中的表达量均高于结肠癌组织。细胞实验结果如下所述,MTT实验结果表明FL118以剂量依赖性明显降低结肠癌细胞的活力,但正常结肠上皮细胞对FL118不敏感;划痕实验和Transwell实验结果表明随着FL118浓度的升高,细胞划痕的距离及Transwell小室中细胞数减少,即细胞迁移和侵袭的能力逐渐降低。此外,显微镜下观察到细胞膜肿胀,甚至破裂导致膜内容物流出的典型细胞焦亡形态学特征,TUNEL染色实验和LDH释放实验结果显示FL118处理组较对照组细胞死亡数显著增加和LDH释放率增加,进一步证明了细胞焦亡现象的发生。重要的是,细胞焦亡关键蛋白GSDMD的表达随着药物浓度升高的现象佐证了细胞焦亡现象的存在。qRT-PCR实验结果表明随着药物浓度的升高,细胞焦亡相关基因的表达均出现了明显的上升;在蛋白水平上,Western Blot实验和免疫荧光实验的检测结果与mRNA水平一致,然后Elisa实验结果证明分泌型蛋白IL-18、IL-1β的表达随FL118浓度的升高而升高。在MTT实验中,当FL118与VX-765共培养时,其细胞活力显著高于单独FL118组;LDH实验结果和GSDMD因子表达结果显示VX-765削弱了FL118对结肠癌细胞的打孔能力;在mRNA和蛋白水平结果均表明相比较于FL118单独用药组,FL118+VX-765组焦亡相关因子的表达明显下降;划痕和Transwell实验结果表明VX-765逆转FL118对结肠癌细胞降低迁移和侵袭的能力。动物实验结果如下所述,小鼠皮下肿瘤重量随FL118浓度的升高而降低,不同组别小鼠体重均没有表现出显著性差异;HE染色结果显示各个脏器形态学未存在明显变化,肺转移模型中肺表面结节数随FL118浓度的增加而减少;TUNEL分析结果表明,细胞死亡数呈现剂量依赖性的上升;免疫组化实验结果表明,NLRP3、Caspase-1及其下游蛋白IL-18、IL-1β的表达均随FL118浓度的增加而升高。结论 FL118通过诱导结肠癌发生Caspase-1介导的细胞焦亡从而抑制其生长和转移;初步验证了NLRP3炎症小体参与了细胞焦亡作用于FL118抑制结直肠癌的过程。意义 证明了细胞焦亡所引发的炎症反应可以抑制结肠癌的生长和转移,完善了FLL18在结肠癌上抗肿瘤的作用机制,重要的是,通过体内实验和体外实验共同验证了结肠癌和细胞焦亡的关系,在细胞焦亡与不同肿瘤作用研究中提供了重要的证据。
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