马立克氏病病毒(Mareks disease virus，MDV)依据基因组结构分类属于疱疹病毒科，α疱疹病毒亚科。MDV分为三种血清型：致瘤性血清Ⅰ型(MDV-1)、非致瘤性血清Ⅱ型(MDV-2)和非致病性血清Ⅲ型(MDV-3)或称火鸡疱疹病毒(herpesvirus of turkeys，HVT)。MDV-1是禽类马立克氏病(Mareks disease，MD)的病原体，其毒力由低至高依次为温和型(m)、毒力型(v)、超强毒力型(vv)和特超强毒力型(vv+)。MD是致死性的淋巴系统增生性疾病并伴随神经系统病变。神经系统病变以早期短暂麻痹(TP)、持续性神经损伤和晚期麻痹等为特征。MDV感染后可引起强烈的细胞因子反应。细胞因子应答在介导细胞免疫反应以及对抗病毒感染过程中起重要作用。MDV可感染中枢神经系统(CNS)并引起不同类型的病理反应。MDV感染后的细胞因子反应在脑组织局部天然免疫反应和免疫病理反应过程中均发挥重要作用。本次实验首先以鸡大脑中的小胶质细胞为研究对象，研究并评价小胶质细胞在vvMDV毒株YL040920和弱毒疫苗株CVI988/Rispens体外感染后的促炎症反应效应。Toll样受体家族(toll-likereceptors，TLRs)识别病毒是诱导促炎症反应发生的关键环节。研究发现，很多病毒和病毒配体可活化TLR2信号并伴随促炎症反应发生。但对于鸡TLRs在MDV诱导促炎症反应发生中的作用还不明确。TLR15属于TLR1家族成员并具有禽类特异性。然而，对于TLR15与病毒感染的关系还无研究。因此，本次实验进一步研究TLR2和TLR15信号在MDV感染后促炎症反应发生中的作用。研究内容和结果如下：　　 1、雏鸡大脑神经胶质细胞培养及小胶质细胞纯化鉴定。从雏鸡大脑皮质得到混合神经胶质细胞培养物。然后通过“振荡-吸附”分离和“吸附-富集”等程序纯化得到小胶质细胞。通过细胞化学染色法检测表达非特异性酯酶的小胶质细胞并确定细胞的纯度。通过双重的“分离-富集”程序，可得到纯化的小胶质细胞单层培养物，其纯度>95%。　　 2、vvMDV毒株YL040920和弱毒疫苗株CVI988/Rispens病毒体外感染小胶质细胞。纯化的小胶质细胞单层分别感染YL040920和CVI988/Rispens病毒。YL040920和CVI988/Rispens活病毒在体外感染小胶质细胞3d后逐渐产生以多处细胞脱落为特征的细胞病变效应(CPE)。使用MDV MEQ的特异性mAb，通过免疫组织化学法检测到病毒感染3d后小胶质细胞核内MEQ蛋白的表达。通过检测MDV meq基因DNA的复制和gB基因mRNA的转录，证明了病毒DNA和特定基因可在小胶质细胞复制和转录。YL040920和CVI988/Rispens病毒感染后meq DNA和gB mRNA均可在小胶质细胞复制和转录，但CVI988/Rispens感染的小胶质细胞的病毒载量和gB mRNA转录水平均显著高于相同数量的YL040920感染的小胶质细胞(P≤0.05/0.01/0.001)。　　 3、MDV-1可感染鸡大脑小胶质细胞并促进其Toll样受体15和1LB基因的转录。分别用YL040920和CVI988/Rispens感染纯化的小胶质细胞用qRT-PCR法检测MDV-1感染对小胶质细胞Toll样受体家族基因转录的影响。结果发现，MDV-1的感染可上调小胶质细胞TLR15和TLR1LB基因的转录水平。小胶质细胞中TLR15和TLR1LB mRNA的转录水平在YL040920感染1d后升高，于3 dpi达到最高值，到5 dpi时有所降低。检测到小胶质细胞中TLR1LB mRNA转录水平在CVI988/Rispens感染1d后升高，到3 dpi时达最高值，而TLR15 mRNA的转录水平在3 dpi后开始升高，二者在5 dpi时均降低。比较YL040920和CVI988/Rispens对TLRs mRNA转录的影响发现vvMDV毒株YL040920感染小胶质细胞后主要促进其TLR15基因的转录(P≤0.01/0.001)，而弱毒疫苗株CVI988/Rispens感染后则主要促进TLRILB基因的转录(P≤0.001)。　　 4、MDV-1感染雏鸡小胶质细胞后细胞因子和iNOS的表达模式。用YL040920或CVI988毒株的活病毒感染纯化的雏鸡小胶质细胞。结果发现，尽管YL040920感染小胶质细胞后病毒载量低于CVI988感染后的病毒载量，但二者促进IFN-γ和IL-12p35 mRNA转录水平增加的程度无显著性差异(P>0.05)。与CVI988相比，YL040920活病毒或固定病毒刺激小胶质细胞后IL-12p40、IL-8和MIP-1β基因的转录显著增加(P≤0.01/0.001)。CVI988(尤其是活病毒)可显著促进小胶质细胞IFN-β mRNA转录，而YL040920促进IFN-β mRNA转录的作用较弱(P≤0.05/0.001)。iNOS基因的转录和NO表达均与YL040920和CVI988感染的水平有关。固定的MDV(尤其是CVI988毒株)具有更强的促进iNOS/NO表达的活性(P≤0.05/0.01/0.001)。研究认为，小胶质细胞是MDV感染后IL-12p40、IL-12p35、IFN-γ、IFN-β、IL-8、MIP-1β、iNOS mRNA和NO等的重要来源。IL-12p35和IFN-γ基因的转录与病毒DNA的复制密切相关；而IL-12p40、IFN-β、IL-8和MIP-1β的转录水平与病毒DNA的复制和病毒特定基因的表达均相关。iNOS mRNA的转录依赖于病毒特定基因的表达，但受病毒复制的抑制。尽管YL040920和CVI988感染小胶质细胞后Th1类细胞因子IFN-γ转录增加的程度并无差异，但YL040920诱导了强烈的IL-12(p40和12p35)、IL-8和MIP-1β反应。　　 5、HVT感染抑制TLR1/2复合体介导的NF-κB活化。用HVT FC-126毒株感染Vero细胞单层。HVT感染后的Vero细胞表现为细胞圆缩，随后病变细胞簇迅速发展为呈针状放射排列。用qPCR检测到病毒感染后Vero细胞内HVT SORF1基因的复制。将pVITRO1-chTLR1LA(1-1)、chTLR1LB(1-2)、chTLR2A(2-1)、chTLR2B(2-2)重组表达质粒和pNiFty2-SEAP用LipofectamineTM2000(Invitrogen)共转染Vero细胞，使其在Vero细胞表达。HVT感染可以显著抑制单独或共转染了chTLR1-1和chTLR1-2的Vero细胞内NF-κB的基础活性(P≤0.01/0.001)。Zymosan可显著促进chTLR1和chTLR2共转染的Vero细胞内的NF-κB活性，HVT感染后还可以显著抑制由Zymosan诱导的NF-κB活化(P≤0.05/0.01)。实验结果显示，chTLR1s(1LA或1LB)参与HVT感染后TLR1/2信号途径的抑制环节。　　 6、MDV-1感染后通过TLR1/2复合体和TLR15活化NF-κB。实验通过RNAi的方式分别抑制TLR1LA、TLR1LB、TLR2A、TLR2B和TLR15在DF-1细胞的表达。结果发现，TLR1/2复合体和TLR15在MDV-1感染后NF-κB活化过程中均起作用(P≤0.01/0.001)，但前者的作用明显强于后者(P≤0.01/0.001)。在TLR1/2复合体中，TLR2B起相对重要的作用(P≤0.05)，而TLR1LA和TLR1LB之间未发现作用的差异(P>0.05)。与感染弱毒疫苗株CVI988病毒相比，TLR15在vvMDV毒株YL040920感染后NF-κB活化过程中的作用相对明显(P<0.05)。　　 概括而言，本课题研究发现MDV-1(包括vvMDV和弱毒疫苗株CVI988)均可感染鸡大脑小胶质细，并分别促进TLR15和TLR1LB基因转录。vvMDV感染小胶质细胞后可诱导强烈的IL-12、IL-8和MIP-1β等促炎症反应，它们可能诱导MDV感染后脑组织局部Th1反应。MDV-1感染后主要通过与TLR1/2复合体相互作用，活化NF-κB，诱导促炎症反应。TLR15在MDV-1(尤其是vvMDV)感染后促炎症反应信号活化过程中也发挥作用，但比较弱。HVT感染可能通过TLR1LA和TLR1LB抑制TLR1/2复合体介导的促炎症反应信号活化。不同血清型和毒力MDV的病原相关模式分子(PAMPs)可能存在差异，这可能是MDVs诱导促炎症反应信号活化的能力存在明显差异的原因。