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[目的]探讨脑肿瘤干细胞裂解物致敏DC疫苗对实验动物脑胶质瘤能否发挥治疗作用。1.建立小鼠GL261脑胶质瘤原位模型,探讨GL261脑胶质瘤的成瘤经过和荷瘤小鼠免疫格局的变化情况；2.探讨GL261细胞的免疫原性和A2B5+GL261细胞的生物学特征；3.研究A2B5+GL261细胞裂解物致敏DC疫苗对小鼠GL261脑胶质瘤的治疗作用,及其可能的作用机制。[方法]1.采用含10%FBS的DMEM培养液在体外培养GL261细胞。采用立体定向注射法将1×105GL261细胞注入同源C57BL/6小鼠右额叶深部,观察小鼠的表现和生存时间。取濒死小鼠的全脑作病理学检查：HE染色和GFAP、 Ki-67和CD3免疫组化染色。2.在C57BL/6小鼠脑内种植1×105GL261细胞后,分别于第4天、第8天、第12天、第16天、第20天、第24天处死3只小鼠,取全脑和脾脏,观察GL261脑胶质瘤的成瘤经过,研究脾指数、脾细胞总数、脾脏T淋巴细胞的变化情况和肿瘤局部CD3+T淋巴细胞的浸润情况。3.分别在C57BL/6小鼠和BALB/C-nu裸鼠皮下种植1×106GL261细胞,观察和比较皮下成瘤情况。采用20GyX射线辐射灭活GL261细胞作为疫苗接种到C57BL/6小鼠皮下,预防性接种组：第0天、第7天两次在C57BL/6小鼠皮下接种1×106辐射灭活GL261疫苗,第12天在小鼠脑内种植1×105GL261细胞；治疗性接种组：第0天在C57BL/6小鼠脑内种植1×105GL261细胞,第7天、第14天、第21天三次在小鼠皮下接种1×106辐射灭活GL261疫苗,比较小鼠的生存时间和脑内成瘤情况。流式检测GL261细胞H-2Kb和H-2I-Ab分子的表达情况。4.采用含20ng/mL EGF.20ng/mL bFGF.2%B27的DMEM/F12无血清培养液在体外培养GL261细胞,流式分选获取A2B5+和A2B5-GL261细胞。进行体外单细胞克隆形成实验,比较A2B5+和A2B5-GL261细胞的克隆形成能力。进行体内成瘤实验：A2B5-GL261细胞按照1×104、1×103、1×102细胞数量梯度进行种植,A2B5-GL261细胞组按照1×105、1×104、1×103细胞数量梯度进行种植,比较A2B5+和A2B5-GL261细胞的成瘤能力。5.采用含15%FBS.l Ong/mL mGM-CSF.10ng/mL mIL-4的RPMI1640培养液在体外培养小鼠骨髓DC细胞。采用反复冻融法裂解A2B5+和A2B5-GL261细胞,并用以致敏DC制备疫苗。致敏DC与脾脏T淋巴细胞共培养,通过CFSE/PI流式检测作体外杀伤实验研究。干预分成两种：成瘤前干预第0天在C57BL/6小鼠脑内种植1×105GL261细胞,第2天、第9天、第16天三次在皮下接种含1×106A2B5+或A2B5-GL261细胞裂解物致敏DC疫苗进行治疗；成瘤后干预第0天在C57BL/6小鼠脑内种植1×105GL261细胞,第12天、第19天、第26天三次在皮下接种含1×106A2B5+或A2B5-GL261细胞裂解物致敏DC疫苗进行治疗,比较小鼠的生存时间和脑内成瘤情况。采用RT-RCR检测A2B5+和A2B5-GL261细胞内gp100和TRP-2基因的表达情况。[结果]1.C57BL/6小鼠脑内种植1×105GL261细胞,可以获得百分之百的脑内成瘤,小鼠生存时间为3-4周,重复性好。GL261脑胶质瘤具有很强的侵袭性,能够模拟人脑胶质母细胞瘤。2.C57BL/6小鼠脑内种植1×105GL261细胞后,早期脑内无成形的脑胶质瘤,第12天开始出现成形的脑胶质瘤,其后肿瘤进行性增大,直至小鼠死亡。早期小鼠的免疫系统被激活,表现为脾指数的上升和脾细胞总数的增多；成瘤后小鼠呈现免疫耐受,表现为脾指数和脾细胞总数的恢复；终末期小鼠的免疫系统被抑制,表现为脾指数的下降和脾细胞总数的减少,Treg细胞比例上升。刚成形的GL261脑胶质瘤内有明显的T淋巴细胞浸润,终末期的GL261脑胶质瘤内仅有零星的T淋巴细胞浸润。3. C57BL/6小鼠皮下种植1×106GL261细胞后,GL261细胞被包裹局限化或被排斥。预防性接种辐射灭活GL261疫苗,能够阻止75%C57BL/6小鼠脑内成瘤；治疗性接种辐射灭活GL261疫苗,不能延长小鼠生存时间。GL261细胞低表达H-2Kb和H-21-Ab分子。4.无血清培养GL261细胞中,A2B5+GL261比例为10.36%。单细胞克隆形成实验发现：A2B5+GL261单细胞克隆形成率为11.5%,A2B5-GL261也能够增殖,但不能形成克隆。1×103A2B5+GL261即能在C57BL/6小鼠脑内成瘤,1×105A2B5-GL261也不能在C57BL/6小鼠脑内成瘤。5.A2B5+和A2B5-GL261细胞裂解物都能致敏小鼠骨髓DC.A2B5+GL261细胞裂解物致敏DC诱导的CTL对A2B5-和A2B5+GL261细胞都有杀伤作用,A2B5-GL261细胞裂解物致敏DC诱导的CTL对A2B5-GL261细胞有杀伤作用,对A2B5+GL261细胞的杀伤作用较弱。成瘤前干预接种A2B5+GL261细胞裂解物致敏DC疫苗能够延长小鼠生存时间,并阻止37.5%的小鼠脑内成瘤,接种A2B5-GL261细胞裂解物致敏DC疫苗能够延长小鼠生存时间,但不能阻止小鼠脑内成瘤；成瘤后干预接种A2B5+或A2B5-GL261细胞裂解物致敏DC疫苗都不能延长小鼠生存时间。TRP-2基因在A2B5+GL261细胞内的表达明显高于A2B5-GL261细胞。[结论]小鼠GL261脑胶质瘤原位模型重复性好,能够模拟人脑胶质母细胞瘤,但GL261细胞具有中等的免疫原性。荷瘤小鼠经历了早期的免疫激活、成瘤后的免疫耐受和终末期的免疫抑制三个阶段。A2B5+GL261细胞具有脑肿瘤干细胞样特征。A2B5+GL261细胞裂解物致敏DC疫苗在体外和在体内的作用,都优于A2B5-GL261细胞裂解物致敏DC疫苗[创新点]1.对GL261脑胶质瘤原位模型小鼠免疫格局的变化作了初步探讨,并提出荷瘤小鼠的免疫格局经历了三个阶段：早期的免疫激活状态,成瘤后的免疫耐受状态,以及终末期严重的免疫抑制状态。2.首次报道采用神经胶质前体细胞标志A2B5,对已经建系的小鼠GL261脑胶质瘤细胞株内的脑肿瘤干细胞进行了研究,并提出A2B5+GL261细胞具有脑肿瘤干细胞样特征。3.首次报道采用神经胶质前体细胞标志A2B5分选细胞裂解物来致敏DC,并提出A2B5+GL261细胞裂解物致敏DC疫苗在体外和在体内的作用,都优于A2B5-GL261细胞裂解物致敏DC疫苗。