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双生病毒因其对农作物巨大的危害已经在世界范围内受到广泛的关注。双生病毒主要是通过昆虫介体在带毒和健康植物之间传播,因此研究昆虫介体传播双生病毒的机制具有重要的意义。番茄黄曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV)是一种在世界范围内造成重大危害的双生病毒,由烟粉虱Bemisia tabaci以持久性可循环的方式特异性传播。TYLCV在烟粉虱体内的循环涉及到复杂的相互作用,然而这些互作的分子机制至今还不明确。中肠是双生病毒粒子侵染烟粉虱的主要屏障也是烟粉虱和病毒互作的关键位置。但是,由于烟粉虱的中肠很小,目前关于TYLCV和烟粉虱中肠相互作用的分子机制还知之甚少。另外,TYLCV可以在烟粉虱体内短时间复制,对其在田间流行和扩散有重要的作用,可是TYLCV在烟粉虱体内复制的过程和机制还不清楚。本文首先利用二代测序技术,比较了 TYLCV侵染前后Middle East-Asia Minor 1(MEAM1)烟粉虱中肠的转录组,试图从转录水平揭示病毒对烟粉虱中肠基因表达的影响。随后,为了找出可能参与病毒复制的烟粉虱蛋白,以TYLCV非结构蛋白为诱饵筛选了烟粉虱cDNA文库。主要研究结果如下:(1)TYLCV侵染后烟粉虱中肠基因表达的变化烟粉虱中肠在TYLCV侵染后与未带毒中肠相比,一共获得了 5,207个差异表达基因。通过对这些差异表达基因的GO和KEGG富集分析发现,与物质运输有关的“Cargo receptor”和“ATP-binding cassette(ABC)transporter”明显富集,这可能有利于病毒的运输进而帮助其穿越中肠屏障。TYLCV侵染以后大量涉及细胞周期和DNA修复过程的基因引显变化,这可能是病毒在中肠细胞内复制所引起的。此外我们的数据显示,TYLCV激活了烟粉虱的多种防御反应,例如抗菌肽和与细胞膜联动的免疫反应。于此同时许多涉及胞内信号转导的分子和通路也被TYLCV激活。这些被激活的免疫系统可能是病毒在烟粉虱中肠中“存活”的最大障碍。(2)酵母双杂交筛选与TYLCV非结构蛋白互作的烟粉虱蛋白分别将TYLCV的5个非结构蛋白基因:AC1、AC2(片段)、AC3、AC4和AV2构建到pGBKT7诱饵载体上,并将其转入Y2HGold酵母菌种,确认无毒性和自激活。采用顺序转化的方法筛选烟粉虱cDNA文库,先在三缺SD/-Trp-Leu-His培养基上筛选,再挑取生长良好的酵母菌落至四缺SD/-Trp-Leu-His-Ade(含X-α-gal和AbA毒素)培养基上。实验共获得1个与AC2、46个与AC3和63个AC4互作的阳性克隆。分离单质粒并测序,回转验证并确认无自激活后,最终筛选到1个与AC2、6个与AC3和11个与AC4互作,并在Genbank有注释的烟粉虱蛋白。综上所述,本研究从基因水平分析了在烟粉虱中肠基因在TYLCV侵染后的表达变化,解释了病毒和介体在特定组织内的复杂关系,为进一步研究昆虫中肠在病毒传播中的作用提供了大量的分子数据;从蛋白水平筛选了直接与TYLCV非结构蛋白互作的烟粉虱蛋白,为我们进一步研究TYLCV复制和与烟粉虱互作机制提供了有价值的分子信息。