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猪δ冠状病毒（PDCoV）是近年新发现的δ冠状病毒成员,以引起仔猪脱水、呕吐、消瘦、急性水样腹泻为主要临床特征,在新生仔猪中有较高的感染率。2012年首次在香港猪粪便中检测到PDCoV,自2014年在美国一些猪场暴发PDCoV后,在美国各州、加拿大、韩国、中国等地均检测到该病毒,给养猪业带来较大的经济损失。目前关于PDCoV的深入研究报道较少,也没有可防治的疫苗及特效药。本试验从河南发生腹泻猪场的仔猪粪便中分离到一株当地流行株CH-01,并对其生物学特性进行研究,对CH-01-P5细胞毒进行全基因组序列测定,并进行了遗传进化进行分析研究,具体内容如下:1.PDCoV CH-01株的分离与鉴定本试验采集河南鹤壁某猪场仔猪腹泻样品,经RT-PCR检测PEDV、TGEV、PRRSV、PRV、PCV等病毒均为阴性,仅PDCoV阳性。将阳性病料处理后接种LLC-PK和ST细胞进行病毒分离,在感染后约80 h出现典型的细胞病变,收获病毒,用RT-PCR鉴定并测序证实所分离的病毒为PDCoV,不含其它猪肠道相关病毒。将该病毒在ST和LLC-PK细胞上进行连续传代,在ST和LLC-PK细胞上均出现典型的细胞病变:在ST细胞上表现为细胞变圆、聚集成团,最终脱落;在LLC-PK细胞表现为细胞圆缩、聚集脱落;病毒在P2-P4代后细胞出现稳定的病变。用PDCoV多克隆抗体进行间接免疫荧光试验,结果显示在细胞质和细胞核中均有荧光信号分布,确定分离出一株PDCoV,将其命名为PDCoV CH-01株。在ST细胞上应用蚀斑纯化技术对CH-01 P5病毒进行纯化,获得了单个克隆毒株,且病毒滴度为1.23×107PFU·mL-1,挑选阳性克隆株传代,并选取P7、P15、P17、P30代细胞毒在LLC-PK细胞上进行TCID50测定,各代病毒滴度在7.0-8.25lgTCID50/0.1 mL之间。2.PDCoV CH-01生物学特性分析目前对PDCoV的生物学特性报道较少,为了测定该病毒生长曲线,本试验在LLC-PK细胞上分别接种不同MOI(10-2、10-4、10-6)的PDCoV CH-01 P30病毒,分别在感染后6、12、24和36 h收获病毒液,提取RNA进行荧光定量检测。结果表明不同MOI的病毒感染细胞后,在24 h病毒RNA滴度达到最高（11.27log10GE/mL）,随后开始下降;选取不同MOI(10-2、10-4、10-6)病毒感染细胞后的不同时间点样品进行TCID50测定,结果表明不同MOI病毒后病毒滴度呈上升趋势,在24 h滴度达到最高(12.50 lgTCID50/0.1mL),随后下降。对病毒进行温度、酸碱、乙醚、氯仿、紫外照射等部分理化特性分析,结果表明病毒在37℃、42℃、50℃处理30 min滴度均下降1-2个TCID50,在65℃处理30 min病毒已完全失活;30 min紫外照射病毒已完全失活;在37℃病毒对pH3.0和pH9.0均敏感,pH9.0病毒已完全失活;对有机溶剂如乙醚、氯仿也敏感,4.8%氯仿处理病毒已基本失活;病毒血凝试验结果表明病毒在4℃、室温、37℃条件下均不与鸡红细胞发生凝集;用不同浓度胰酶处理病毒,与鸡红细胞也不发生凝集。3.PDCoV CH-01 P5全基因组测序和遗传进化分析为了解PDCoV CH-01株在细胞传代过程中所发生的遗传变异情况,参照GenBank HKU15-155（JQ065043）PDCoV全基因序列,设计合成了13对引物,对CH-01-P5进行全基因扩增,并将其全基因序列与PDCoV CH-01（原始病料株）及国内外毒株进行序列比对,结果表明CH-01-P5毒株与CH-01（原始病料株）同源性最近（100%）,氨基酸和核苷酸未发生改变,细胞适应毒株未发生变异,可能与细胞毒株传代较低有关。全基因组序列遗传进化分析表明,PDCoV国内外毒株分为两个大亚群,其中CH-01-P5与CH-01、国内所有毒株、美国及韩国毒株处在一个大的亚群中;CH-01-P5毒株氨基酸同源性与其他PDCoV毒株同源性为98.6%100.0%,与中国香港、大陆毒株亲缘性最近,与美国、韩国毒株亲缘性次之,与泰国、越南、老挝毒株亲缘性较远。PDCoV CH-01-P5的结构基因序列分析表明,M基因氨基酸同源性为98.9%-100%,N基因氨基酸同源性为97.1%-100%,S基因氨基酸的同源性为95.9%-99.9%,其中M、N、E基因中的碱基基本未发生突变,S基因有3个核苷酸缺失,12个核苷酸突变（其中有5个氨基酸改变）,河南流行毒株是否发生变异,尚需进一步研究。综上所述,本试验已成功分离出一株PDCoV,并将其命名为CH-01,并对病毒生长规律、部分理化特性及遗传进化进行分析,为PDCoV毒株的进一步研究提供了数据参考,同时为PDCoV的防治及疫苗研发提供了重要的理论依据。