叉头框蛋白1（Forkhead box protein O1,FOXO1）是生物体内一类关键的细胞调控因子之一,主要通过转录和传导各种细胞因子信号发挥其生物学功能。在哺乳动物肝脏组织内,FOXO1通过抑制脂肪酸从头合成关键调控因子SREBP1的表达,进而抑制脂肪酸的从头合成同时促进脂肪酸的分解,最终改变细胞中脂肪酸组成,维持机体内脂质平衡。但FOXO1在反刍动物的乳腺组织中是否调控脂肪酸代谢过程仍不清楚。羊奶富含多种脂肪酸,尤其是对人体健康有益的短、中链脂肪酸和不饱和脂肪酸,并且半数以上的脂肪酸来自于从头合成。因此,研究FOXO1在奶山羊乳腺组织中的基本功能以及FOXO1对脂肪酸代谢基因的转录调控机理,对奶山羊育种以及提高羊奶营养价值具有重要的理论和实践意义。本研究通过CHIP-seq技术获得组蛋白H3K27ac在山羊不同泌乳时期乳腺组织中的富集数据;通过腺病毒介导的过表达和干扰技术,对FOXO1在乳腺上皮细胞中的功能进行验证;通过外源添加胰岛素,对FOXO1的转录活性进行了探讨;通过对FOXO1靶基因ATGL的过表达研究,探讨了其对脂滴合成以甘油三酯降解的影响;利用缺失突变以及定点突变等技术,研究了FOXO1对SREBP1以及ATGL基因的转录调控机制。主要研究结果如下:1.基于CHIP-seq的FOXO1转录调控因子的筛选。选择液氮研磨法对奶山羊乳腺组织预处理;根据超声结果采用Bioruptor Pico仪器,并将参数设置为30 s ON、30 s OFF、24 cycle可获得100-500 bp的DNA片段;通过检测富集DNA的含量,确定抗体最适使用量为5μL。同时,分析不同泌乳时期乳腺组织组蛋白H3K27ac CHIP-seq数据发现,泌乳盛期H3K27ac在FOXO1增强子区的信号富集显著高于干奶期。推测,FOXO1在乳腺组织的泌乳过程中发挥重要作用。2.山羊FOXO1基因的过表达研究。克隆得到山羊FOXO1基因CDS区序列（2 004bp）,并包装并扩繁出高滴度的Ad-FOXO1腺病毒。腺病毒感染细胞后,FOXO1基因的m RNA水平上调500倍左右,并且蛋白水平也显著提高。与对照组相比,过表达FOXO1显著下调了脂肪酸合成相关基因FASN,ACACA,SCD1,PLIN3,XDH,ACOX1以及CD36的表达量。同时,过表达FOXO1显著下调了甘油三酯的含量以及甘油三酯合成相关基因DGAT1和LPIN1的m RNA水平,细胞中C16:0及C18:1的含量显著降低,而C18:0的含量显著增加。3.山羊FOXO1基因的干扰研究。设计并合成3对靶向FOXO1的特异性sh RNA,包装出高滴度的Ad-sh FOXO1腺病毒,分别感染乳腺上皮细胞后,Ad-sh RNA2对FOXO1的干扰效率最高,m RNA水平可降低70%以上,并且蛋白水平也显著减少。实时定量结果表明,干扰FOXO1显著上调了SREBP1,FASN,ELOVL6,SCD1,CD36,DGAT2,GPAM及PLIN2基因的表达量,并下调了PPARA和ATGL的m RNA水平。同时,FOXO1基因的干扰增加了细胞内脂滴的积累与甘油三酯的含量。此外,干扰FOXO1可显著促进细胞的增殖,对细胞凋亡蛋白Caspase 3的蛋白表达没有影响。4.胰岛素对FOXO1基因表达活性的影响研究。胰岛素处理乳腺上皮细胞可显著上调脂肪酸从头合成相关基因SREBP1,FASN及ACACA的表达量,且细胞内甘油三酯含量显著增加。同时,胰岛素的添加能够激活PI3K/AKT信号通路,使磷酸化的AKT（p-AKT）及p-PI3K蛋白显著增加,从而使FOXO1蛋白发生磷酸化从细胞核转移至细胞质,导致细胞核中FOXO1蛋白显著减少,细胞质中磷酸化FOXO1（p FOXO1）蛋白显著增加。添加PI3K/AKT信号通路的抑制剂（LY294002）后,p-PI3K与p-AKT蛋白水平显著减少,p FOXO1的蛋白水平也受到影响。与单独胰岛素处理相比,过表达FOXO1并用胰岛素处理细胞,可显著下调SREBP1,FASN及ACACA的表达量以及细胞内脂滴的含量,同时高于过表达FOXO1处理组,表明胰岛素可以减弱FOXO1对脂质合成的抑制作用。5.FOXO1对SREBP1基因转录活性调控作用。过表达FOXO1显著下调SREBP1基因的表达及启动子活性。干扰FOXO1具有相反的效应。缺失突变结果表明,过表达FOXO1对不同缺失片段的SREBP1启动子活性均有抑制作用,并在启动子核心区域抑制作用最强。T0901317（LXRα激动剂）处理显著上调SREBP1的启动子活性,而过表达FOXO1减弱了T0901317对SREBP1启动子的诱导作用。生物信息学分析发现,SREBP1启动子上存在两个LXRE位点和两个SRE位点。定点突变LXRE位点后,过表达FOXO1仍能下调SREBP1启动子的活性,且LXRE位点的突变不能消除T0901317对SREBP1启动子的诱导作用。LXRE和SRE位点同时突变导致FOXO1对SREBP1启动子的抑制作用消失。表明,FOXO1同时通过LXRE和SRE元件调控SREBP1启动子的转录活性。胰岛素处理乳腺上皮细胞后,SREBP1启动子的活性显著上调,而过表达FOXO1减弱了胰岛素对SREBP1启动子的诱导作用。6.山羊ATGL基因过表达对甘油三酯及脂滴合成的影响。包装高滴度的Ad-ATGL腺病毒,感染乳腺上皮细胞后,ATGL基因的m RNA水平上调1000倍左右,蛋白水平上调20倍左右。过表达ATGL可以显著下调脂质代谢相关基因PPARA,ADRP,BTN1A1以及CD36的表达量,并显著上调脂解基因HSL的表达。同时,过表达ATGL降低了细胞内脂滴的积累和甘油三酯的含量,且增加了细胞内游离脂肪酸的含量,而对培养基中的游离脂肪酸没有影响。7.FOXO1调控ATGL基因转录活性研究。克隆得到ATGL启动子2 240 bp序列。生物信息学分析发现,ATGL启动子存在FOXO1,STAT5A,LXR,NF-Y以及SP1等转录因子的结合位点。双荧光素酶活性实验发现,干扰FOXO1可以显著下调ATGL启动子的活性。缺失突变结果表明,ATGL启动子的核心区域位于-882 bp～-524 bp,并且在核心区域内存在两个FOXO1的结合位点（FKH1和FKH2）。FKH元件的单独突变或同时突变均能显著下调ATGL启动子的活性,并且导致FOXO1对ATGL启动子的激活作用减弱。染色质免疫共沉淀实验表明,FOXO1在体内可以直接结合在ATGL启动子的FKH元件上,并且对FKH2的亲和性高于FKH1位点。综上所述,本研究确定了山羊染色质乳腺组织免疫共沉淀最适方法,并解析了H3K27ac在FOXO1基因上的富集。外源因子胰岛素通过改变FOXO1的定位进而抑制其转录活性。FOXO1基因通过调控SREBP1和ATGL基因的转录,并影响乳脂代谢相关基因表达,最终抑制脂肪酸的从头合成同时促进脂肪酸脂解过程,从而参与奶山羊乳脂代谢过程中。本研究为进一步阐明羊奶脂肪酸含量组成调控机制提供理论和实验依据。