目的：微小病变型肾病(Minimal change disease,MCD)和局灶节段性肾小球硬化(Focal segmental glomerulosclerosis, FSGS)是肾病综合征的常见病理类型。其发病机制在于足细胞的损伤,足细胞的功能障碍和丢失是促使肾小球硬化发生、肾脏疾病进展的关键环节。足细胞作为终末分化细胞,如何维持其自身功能显得尤其重要。而自噬是细胞应对各种损伤、应激,维持其内环境稳定的重要机制之一。研究所前期研究发现microRNA-30a (miR-30a)与足细胞的损伤机制密切相关,肿瘤方面研究表明miR-30a可通过调节Beclin 1介导的自噬来增加肿瘤的化疗效果。本研究拟探讨miR-30a是否通过调节Beclin 1来影响足细胞自噬及足细胞自噬在足细胞损伤及蛋白尿产生中的意义。方法：研究分二部分。第一部分：足细胞病患者肾小球足细胞自噬。利用电镜观察足细胞自噬体阳性率。选取MCD病例30例、FSGS病例30例,尿蛋白定量≥3.5g/24h,观察不同疾病自噬体阳性率。选取首次肾活检诊断MCD,重复肾活检为FSGS的病例9例,重复活检仍为MCD的病例12例；观察疾病进展时足细胞自噬体阳性率。采用透射电镜观察肾小球足细胞数,计算含自噬体的足细胞占足细胞总数的比率,记为足细胞自噬体阳性率。采用免疫荧光方法观察自噬在肾小球中的定位。第二部分：miR-30a对Beclin 1介导的足细胞自噬的影响及其在足细胞损伤中的作用研究。(1)采用氨基核苷嘌呤霉素(puromycin aminonucleoside, PAN)致足细胞损伤模型,观察足细胞的自噬水平、Beclin 1、miR-30a的表达,免疫荧光法和Western blot检测自噬水平和Beclin 1表达,qRT-PCR检测miR-30a水平；利用miR-30a过表达足细胞系,自噬抑制剂三甲基腺嘌呤(3-methlyadenine,3-MA)和氯喹(chloroquine)、Beclin 1 siRNA转染足细胞抑制足细胞自噬,观察自噬在PAN诱导的足细胞损伤中的意义,探讨足细胞中miR-30a与Beclin 1及自噬之间的相互关系。流式细胞仪观察各组足细胞凋亡变化。(2)利用PAN损伤大鼠模型,观察自噬抑制(3-MA和miR-30a过表达质粒)和自噬激活(雷帕霉素)对PAN诱导蛋白尿产生和足细胞病变的影响。常规生化方法测定2周内不同时间点的尿蛋白定量和第4、7、21天血清肌酐、血清胆固醇、血三酰甘油的变化,电镜观察肾组织的病理改变。qRT-PCR检测相应肾组织中miR-30a的水平,Western blot检测Beclin 1表达和LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的变化,采用免疫荧光或免疫组化法检测各组肾组织自噬体标记物Beclin 1、LC3和P62、足细胞损伤标记物Podocin或Synaptopodin的表达。结果：第一部分：采用电镜和免疫荧光证实了足细胞中存在自噬体。FSGS患者足细胞自噬体阳性率较MCD患者少(26%±0.19 vs 37%±0.16,P<0.05),进展为FSGS的患者足细胞自噬体阳性率较首次肾活检时下降明显(450／-0.10 vs22%±0.11,P<0.05),而仍表现为MCD的患者自噬体阳性率无明显下降(39%±0.08 vs 39%±0.10,P>0.05)。第二部分： (1)PAN处理后足细胞标记物降低,较正常对照组凋亡增加(P<0.05); PAN诱导足细胞Beclin 1表达、自噬增加,miR-30a的水平下降,与对照组相比具有统计学意义(P<0.05)。(2)与miR-NC转染足细胞组相比,miR-30a过表达能抑制PAN诱导的足细胞自噬体增多,致Beclin 1蛋白表达、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ下降(P<0.05)。足细胞miR-30a过表达在足细胞损伤早期可促进PAN诱导的足细胞凋亡(PAN 20ug/ml:14.8±0.85% vs 9.6±1.54%; PAN35ug/ml: 15.4±1.41% vs 10.95±0.75%, P<0.05)及足细胞标记物显著降低(P<0.05)。(3)自噬抑制剂3-MA和氯喹、Beclin 1 siRNA转染足细胞促进足细胞凋亡和足细胞标记表达下降,较正常对照组差异具有统计学意义(P<0.05)。(4)自噬抑制加重PAN肾病大鼠尿蛋白及足细胞病变：蛋白尿产生提前,蛋白尿加重,足突融合程度加重,足细胞标记物表达下降；自噬激活减轻PAN肾病大鼠尿蛋白及足细胞病变,足突融合减轻。PAN (4mg/100g)处理Wistar大鼠第7天出现蛋白尿,第10天达到高峰,伴有血清肌酐、胆固醇、三酰甘油的升高,第14天蛋白尿明显下降至正常。电镜观察第4天和第20天足细胞足突节段融合,足细胞标记物Podocin和Synaptopodin呈节段缺失,表达未减弱；第7天时足突广泛融合,Podocin和Synaptopodin表达明显下降。而miR-30a过表达组和3-MA组大鼠提早即第4天出现蛋白尿,第14天开始下降,20天较对照组仍有少量蛋白尿,并伴有足细胞足突广泛融合；Podocin和Synaptopodin广泛失去连续、线形分布,呈颗粒状分布,表达明显减弱。与PAN模型组相比,雷帕霉素(Rapamycin)组可在一定程度上减轻大鼠尿蛋白,第7天时电镜下足细胞足突节段融合,足细胞标记物Podocin和Synaptopodin呈节段缺失,表达无明显减弱(P<0.05)。结论：(1)足细胞病进展为FSGS的患者足细胞自噬体阳性率减少,FSGS患者足细胞自噬较MCD减少,表明足细胞自噬在足细胞损伤和足细胞病变进展中起着重要作用。(2) miR-30a能通过负性调控Beclii 1来抑制足细胞自噬,加重PAN诱导的足细胞损伤。(3)自噬抑制后PAN诱导的大鼠蛋白尿产生提前,程度加重,足突融合加重,自噬激活后PAN诱导的大鼠蛋白尿程度下降,足突融合减轻。上述结果提示自噬在维持足细胞的正常功能,抵抗外来因素损伤起着重要作用。