目的:基础疾病、手术创伤和术中体位改变等会对患者生理功能造成不同程度的影响,病人围术期极易发生心脑脆弱器官的缺血/再灌注损伤,并且术中呼吸和循环系统的稳定直接影响病人术后恢复,因此如何保证患者围术期安全,预防围术期不良事件的发生是麻醉医生面临的重大挑战。LOC339524是课题组于2012年在研究人心脏早期停跳灌流液的蛋白质组学时通过高效液相色谱-芯片/质谱(High performance liquid chromatography-chip/mass spectrometry,HPLC-Chip/MS)技术分离、鉴定的新蛋白,随后制备了单克隆抗体5-D3。前期研究发现LOC339524可能参与了胚胎期大鼠心脏的发育,并且能调控H9C2心肌细胞的分裂增殖。除此之外,课题组前期研究还证实LOC339524参与大脑炎症的调控,其高表达可以明显减轻脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)导致的小胶质细胞炎症反应。这些均提示LOC339524具有重要的功能,可能参与器官保护。但LOC339524在心肌缺血/再灌注损伤中的作用和机制尚不清楚,并且其减轻BV-2小胶质细胞炎症反应的可能信号通路也尚未明确。因此本研究旨在通过建立LOC33524过表达的AC16和BV-2稳转细胞株,并给予相应损伤的情况下,探究LOC33524过表达在心肌氧糖剥夺/复氧损伤中的保护作用和机制,及其减轻炎症反应的可能通路,为开发特异性的心脑保护药物提供新的靶点。此外,细胞色素c还原酶核心蛋白1(Ubiquinol-cytochrome-c reductase complex core protein 1,UQCRC1)也是课题组筛选到的可能具有心肌保护作用的蛋白。前期研究提示,UQCRC1表达变化会直接影响线粒体功能,表现为线粒体功能障碍常常伴有UQCRC1下调,而过表达UQCRC1会明显增加复合体Ⅲ呼吸率,表明UQCRC1对线粒体功能的维持十分重要。多项研究表明线粒体是包括预处理在内的多种心肌保护方式的共同作用靶点,但参与预处理介导心肌内源性保护效应的线粒体蛋白尚不明确。本研究旨在通过长期注射二氮嗪(Diazoxide,DZ)构建大鼠的心肌保护模型,分离心肌线粒体内膜(Mitochondrial inner membrane,MIM)蛋白后,筛选出MIM中可能产生保护作用的靶蛋白,并从细胞水平加以证实。为进一步寻找预处理时心肌细胞主动产生内源性保护分子的机制、开发围术期心肌保护药物提供理论依据。第一部分LOC339524对心肌缺血/再灌注损伤的保护作用及其机制研究第一部分方法:1.探讨LOC339524表达蛋白的可能性。1.1探讨LOC339524外源性表达蛋白。将构建C端融合有FLAG标签的LOC339524表达质粒,以lipofectamine TM 3000为载体,转染至293T细胞,48h后提取蛋白,FLAG抗体检测蛋白的表达情况。1.2探讨LOC339524内源性表达蛋白。在荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization,FISH)再次证实大鼠可以表达LOC339524的前提下,提取了成年SD大鼠心,脑,脾,肾等主要组织蛋白,Western Blot分析了LOC339524蛋白在上述组织器官的内源性表达。2.探讨缺氧对LOC339524表达的影响。2.1在细胞水平明确缺氧对LOC339524表达量及位置的影响。人心肌AC16细胞置于缺氧(1%O2)环境24h或者用200μmol/L Co Cl2作用10h,提取RNA和蛋白,RT-q PCR和Western Blot分别检测了缺氧对LOC339524基因和蛋白表达的影响。同时分别提取常氧和缺氧环境中AC16细胞胞浆蛋白和胞核蛋白,Western Blot分析了LOC339524蛋白在缺氧条件下的表达位置变化。2.1在动物水平明确缺氧对大鼠心肌和血清外泌体LOC339524表达的影响。将成年SD大鼠置于模拟海拔5000m高原环境的人工实验舱0~72h,处死大鼠,收集血清外泌体及心肌组织。RT-q PCR检测心肌LOC339524 m RNA的表达;Western Blot评估心肌和血清外泌体LOC339524蛋白的表达。3.探讨无义介导的m RNA降解(Nonsense-Mediated m RNA Decay,NMD)途径对LOC339524调控的可能性。3.1激活或抑制NMD途径后,探讨LOC339524基因和蛋白水平的变化。构建NMD途径中关键因子上游移码蛋白1(up-frameshift protein 1,UPF1/RENT1)的高表达慢病毒(LV-TOPO-UPF1/RENT1),将其转染至AC16、H9C2、HMO6和LO2四种细胞中,构建上述细胞的UPF1/RENT1高表达稳转细胞株;或者采用si RNA沉默上述四种细胞中UPF1/RENT1的表达后,RT-PCR和Western Blot分别检测了LOC339524基因和蛋白水平的表达变化。3.2探讨LOC339524逃逸NMD调控的可能机制。构建LOC339524高表达慢病毒(LV-TOPO-LOC339524),将其转染至AC16细胞中,建立AC16高表达LOC339524的稳转细胞株。提取蛋白,Western Blot分析了磷酸化真核生物翻译起始因子2α(Phospho-eukaryotic translation initiation factor 2α,p-e IF2α)的表达变化。4.采取下述方法探讨LOC339524介导心肌氧糖剥夺/复氧(Oxygen and glucose deprivation/Reoxygenation,OGD/R)的保护作用及其可能机制。4.1筛选OGD/R最佳时间点。将AC16和AC16-LOC339524+/+细胞分别氧糖剥夺0/3/6/9/12/24/48/72h,复氧12h,收集细胞并对其进行Annexin V-FITC/PI或JC-1染色,采用流式细胞术评估氧糖剥夺不同时间/复氧12h的细胞凋亡变化,后续研究采用上述两种方法均检测到凋亡变化最显著的OGD/R时间点。对于筛选到的时间点,再通过Western blot检测细胞凋亡相关蛋白——活化的caspase3、聚ADP-核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase,PARP1)和bcl-2的表达来加以验证。4.2转录组测序(RNA-seq)分析了LOC339524过表达后的差异基因以及差异信号通路(着重分析了PI3K通路和MAPK通路),并初步探讨了差异基因间的相互作用网络,为后续信号通路的筛选提供参考。RNA-seq结果的可靠性由RT-q PCR和Western Blot加以鉴定。4.3探讨LOC339524对PDGFR/PI3K/Akt通路蛋白的影响。在RNA-seq的提示下,对细胞进行OGD/R损伤,提取蛋白,Western Blot分析PDGFR/PI3K/Akt通路中PDGFRα(Tyr754),PDGFRβ(Tyr751)、PIK3C2B(Y228)、Akt(Thr308),Akt(Ser473)和GSK3β(Ser9)总蛋白及其磷酸化水平的变化,初步探究高表达LOC339524对PDGFR/PI3K/Akt通路蛋白的影响。4.4使用PDGFR和PI3K抑制剂,反向证实LOC339524产生心肌保护作用的可能机制。在细胞进行OGD/R损伤前,使用PDGFR抑制剂Crenolanib(1umol/L)和PI3K特异性抑制剂LY294002(10umol/L)或Wortmannin(100nmol/L)抑制相应蛋白的激活,采用流式细胞术评估使用上述抑制剂对细胞凋亡的影响;Western Blot检测PDGFRα(Tyr754),PDGFRβ(Tyr751)、PIK3C2B(Y228)、Akt(Thr308),Akt(Ser473)和GSK3β(Ser9)磷酸化水平的变化,以及cleaved caspase3、PARP1-83kd和bcl-2的改变,明确LOC339524产生心肌保护作用的可能机制。第一部分结果:1.LOC339524基因可以编码蛋白。正常情况下,采用抗体5-D3在大鼠的主要组织中均能检测到LOC339524蛋白的内源性表达,并以肝脏、心肌和子宫中表达最多。此外,FLAG抗体在~29k Da处检测到蛋白条带,说明LOC339524基因可以外源性的编码蛋白。2.缺氧能诱导LOC339524表达并出现胞核到胞浆的转移。在体外,无论是物理性缺氧(1%O2)还是通过Co Cl2模拟的化学性缺氧均可诱导AC16细胞高表达LOC339524,并且可从胞核转移至胞浆;在体内,大鼠心肌组织中LOC339524的表达随着缺氧时间延长而增加,当缺氧达到72h,血清外泌体中LOC339524表达显著上升。3.LOC33924可能通过调控p-e IF2α表达逃逸NMD调控。无论是通过慢病毒高表达UPF1/RENT1或采用si RNA沉默UPF1/RENT1,LOC33924基因和蛋白水平均不符合NMD调控理论上的下降或增高;而高表达LOC339524后,p-e IF2α表达显著高于对照组。4.当氧糖剥夺24h/复氧12h时,LOC339524通过调控PDGFR/PI3K/Akt通路,明显减轻AC16细胞遭受的OGD/R损伤。4.1氧糖剥夺24h/复氧12h是LOC339524保护AC16心肌细胞的最佳作用时间点。在氧糖剥夺0~9h/复氧12h时,Annexin V-FITC/PI和JC-1检测到的细胞凋亡率均随着氧糖剥夺时间的延长而略微增加,此时LOC339524过表达组的凋亡率略少于对照组(无统计学意义);当氧糖剥夺12~24h/复氧12h时,细胞凋亡率明显增加,此时LOC339524过表达组凋亡率较对照组大大降低(具有统计学意义),且在氧糖剥夺24h/复氧12h组最为明显;当氧糖剥夺达48~72h/复氧12h时,尽管LOC339524过表达组仍表现出明显的保护作用,考虑到此时细胞整体的凋亡率极高,故最终将氧糖剥夺24h/复氧12h作为后续血细胞损伤的时间点。在此时间点上,Western Blot的检测LOC339524高表达组活化的caspase3及其下游蛋白PARP1-83kd的表达显著少于对照组,保护性蛋白bcl-2明显增加。4.2 LOC339524可能通过PDGFR/PI3K/Akt通路保护心肌细胞。4.2.1 RNA-seq结果提示,LOC339524过表达后PI3K通路的16个基因以及MAPK通路的15个基因明显高表达。4.2.2 Western Blot证实LOC339524过表达会明显增加PI3K通路中PDGFRα(Tyr754),PDGFRβ(Tyr751)、PIK3C2B(Y228)、Akt(Thr308),Akt(Ser473)和GSK3β(Ser9)磷酸化水平,进而使OGD/R损伤后Annexin V-FITC/PI染色阳性的细胞比例以及线粒体膜电位JC-1下降的细胞比例均显著少与对照组。4.2.3在OGD/R前,使用Crenolanib预处理1h,抑制PDGFRα和PDGFRβ激活,尽管此时整体凋亡增加,但相较于Control+Crenolanib组,p-PDGFRα(Tyr754)仍然明显增加,活化的Caspase3和PARP1-83kd的表达显著降低,bcl-2蛋白明显增高,线粒体膜电位下降的细胞比例也较对照组明显减少,即LOC339524过表达组仍然具有减轻凋亡的作用。4.2.4在OGD/R前,使用LY294002或Wortmannin抑制Akt激活,尽管p-Akt(Thr308)、p-Akt(Ser473)和p-GSK3β(Ser9)表达均显著下降,但LOC339524过表达组仍明显高于对照组,活化的caspase3和PARP1-83kd的表达少于对照组,bcl-2表达高与对照组,Annexin V-FITC/PI染色阳性细胞比例也显著低于对照组。第二部分LOC339524抑制脂多糖诱导的BV-2小胶质细胞炎症反应的机制研究第二部分方法:5.以生物信息学分析和转录组学为基础,在细胞水平探讨LOC339524减轻BV-2小胶质细胞炎症的机制。5.1明确LOC339524对LPS诱导炎症介质的影响。在BV-2细胞高表达LOC339524或通过si RNA沉默LOC339524后,100ng/m L LPS作用12h,免疫荧光检测炎症介质环氧化酶-2(Cyclooxygenase-2,COX-2)和诱导型一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase,i NOS)的变化。5.2探讨NF-κB与LOC339524启动子结合情况,以及对LOC339524表达的影响。构建LOC339524启动子1509-1520、2000-2009、2758-2769和2971-2981区域的野生型及其相应突变型载体,给予25ng/m L肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factorα)TNF-α刺激24h或者刺激前使用IκBα特异性抑制剂PDTC(0.5μmol/L)预处理1h,通过双荧光素酶实验,检测各组荧光OD值。5.3在细胞水平探讨LOC339524减轻LPS诱导的炎症反应的可能机制。5.3.1明确LOC339524对NF-κB/p65核移位的影响。BV-2细胞改变LOC339524表达后,100ng/m L LPS作用3h,免疫荧光检测核因子-κB/p65(Nuclear factor-κB/p65,NF-κB/p65)的变化;同时分别提取胞浆蛋白和胞核蛋白,Western Blot分析NF-κB/p65在胞质和胞核的表达。5.3.2明确LOC339524对Src/NF-κB和p38MAPK通路的影响。BV-2细胞改变LOC339524表达后,100ng/m L LPS作用30min,提取蛋白,Western Blot检测了Src和NF-κB通路中的核因子-κB抑制物激酶(inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase,Ikk)、核因子-κB抑制因子α(NF-kappa-B inhibitorα)以及NF-κB/p65的磷酸化。或在LPS刺激前,使用IκBα特异性抑制剂PDTC(0.5μmol/L)或p38MAPK特异性抑制剂SB203580(20μmol/L)预处理1h,Western Blot分析了IκBα、NF-κB/p65和p38MAPK的磷酸化。第二部分结果5.LOC339524可能通过Src/NF-κB和p38MAPK通路减轻LPS诱导的BV-2小胶质细胞炎症反应。5.1 LOC339524减少炎症介质的表达。过表达的LOC339524可显著减少LPS诱导的BV-2细胞COX-2和i NOS表达以及NF-κB/p65的核移位,LOC339524沉默则结果相反。5.2 NF-κB与LOC339524启动子1509-1520区域结合并激活该基因的表达。TNF-α刺激后,LOC339524-1520启动子载体荧光OD值明显高于非刺激组和突变组(LOC-MUT-1520组),而其他启动子区域载体的荧光OD值则没有明显变化。5.3 Src/NF-κB和p38MAPK通路是LOC339524减轻炎症反应的可能机制。5.3.1 LOC339524抑制Src的活性。LOC339524高表达后,LPS刺激引起的Src(Tyr527)(磷酸化后抑制Src)的磷酸化明显增多,而对Src(Tyr 416)(磷酸化后激活Src)位点磷酸化无影响;LOC339524沉默后,则Src(Tyr 527)磷酸化减少,Src(Tyr 416)位点磷酸化仍无变化。5.3.2 LOC339524显著降低LPS诱导的NF-κB和p38MAPK通路的激活。与con+LPS组相比,Ikkα/β、IκBα和NF-κB/p65磷酸化均显著减少;当LOC339524沉默后,则Ikkα/β、IκBα和NF-κB/p65磷酸化明显高于NC+LPS组。而在LPS刺激前,使用PDTC特异性抑制IκB的激活后,可以显著减少LOC339524沉默对IκB和NF-κB/p65的磷酸化;而在LPS刺激前,使用SB203580特异性抑制p38MAPK的激活,则能够明显减少LOC339524沉默对p38MAPK的磷酸化。第三部分UQCRC1在药物预处理大鼠心肌保护中的作用研究第三部分方法6.通过以下方法筛选和初步证实线粒体内膜中可能参与预处理介导心肌保护的靶蛋白。6.1建立大鼠心肌保护模型。首先采用腹腔单次注射50 mg·kg-1异丙肾上腺素素(isoproterenol hydrochloride,ISO)来建立大鼠心肌损伤模型;或在构建大鼠心肌损伤模型前,腹腔连续注射20mg·kg-1·d-1二氮嗪(diazoxide,DZ)不同时间(3d~8W);或在给与DZ的同时联合使用80 mg·kg-1·d-1 5-羟基癸酸(5-hydroxydecanoic acid,5-HD),具体分组如下:1)第1组为control组。2)第2组为ISO组:仅皮下注射ISO(50 mg·kg-1溶于生理盐水中)。3)第3组为DZ+ISO组:在注射ISO之前,大鼠连续3天每天腹腔注射20mg·kg-1·d-1的DZ。4)第4,5,6,7和8组大鼠在注射ISO之前,分别接受腹腔注射1,2,4,6和8周的DZ(20 mg·kg-1·d-1,每天注射一次)。在给药期间,所有其他组给予等体积的生理盐水。5)第9组中,大鼠在注射ISO之前,5-HD与DZ一起给予8周。6.2在ISO注射后4h,断颈处死大鼠,收集心脏,筛选MIM中的靶蛋白。1)部分组织进行石蜡包埋,TUNEL染色观察上述分组中心肌组织的凋亡情况;2)部分心肌用于提取MIM蛋白,通过二维荧光差异凝胶电泳(two-dimensional fluorescence differential gel electrophoresis,2D-DIGE)结合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry,MALDI-TOF-MS)分析了DZ 0w,4w和6w心肌MIM中的差异蛋白;3)Western Blot检测了DZ处理0w,4w和6w后筛选到的UQCRC1表达变化。6.3在细胞水平进一步探讨UQCRC1的心肌保护作用。使用100μmol/L DZ作用H9C2细胞24h,或100μmol/L DZ和100μmol/L 5-HD共同作用H9C2 24h,Western Blot评估上述分组中UQCRC1表达的改变;随后将细胞进行OGD/R损伤,Hoechst33342染色检测细胞的凋亡情况;H9C2细胞进行OGD/R损伤前,采用si RNA沉默UQCRC1表达,Hoechst33342染色进一步评估细胞的凋亡变化。第三部分结果:6.UQCRC1可能是二氮嗪预处理时心肌细胞主动产生内源性保护的靶蛋白。6.1成功建立大鼠心肌保护模型。ISO组中大鼠心肌TUNEL阳性细胞比例明显高于对照组;当DZ作用时间较短(<4w),此时DZ表现出明显的保护效应:TUNEL阳性细胞比例较ISO组显著减少;当DZ作用时间>4w后,DZ的保护效应不仅消失,反而表现为损伤作用:TUNEL阳性细胞比例明显上升;在使用DZ的同时联合5-HD,可以部分逆转因DZ长时间作用引起的保护丧失。6.2 DZ长时间处理后心肌MIM的差异蛋白中,UQCRC1的表达变化与DZ处理后心肌保护变化一致。当DZ作用时间较短(<4w)时,心肌MIM蛋白中UQCRC1表达显著增加;而当时间>4w时,UQCRC1表达明显减少。6.3 UQCRC1明显减轻H9C2细胞遭受OGD/R损伤。相较于Control组,DZ 24h组可明显增加UQCRC1的表达,而在联合使用5-HD后,DZ 24h组高表达UQCRC1的作用消失;与之对应的是,在OGD/R损伤后,DZ 24h组Hoechst33342染色为强蓝色的细胞比例明显低于Control组,联合使用5-HD则Hoechst33342染色为强蓝色的细胞比例显著增加。通过si RNA明显减少UQCRC1的表达,再对细胞进行OGD/R损伤,si UQCRC1组Hoechst33342染色为强蓝色的细胞比例明显多于NC组。结论:1.首次证实一个被注释为Lnc RNA的LOC339524可以编码蛋白,且该蛋白在主要的组织器官中均有表达,具有重要的功能。2.缺氧可以诱导LOC339524在大鼠心肌和AC16细胞中高表达。而LOC339524可以通过激活AC16细胞PDGFR/PI3K/Akt通路,减轻OGD/R损伤,增加存活率。3.LOC339524减轻LPS诱导培养的BV-2小胶质细胞炎症反应,是通过抑制Src活性,进而抑制下游的两条信号通路。一条是NF-κB通路,另一条是p38MAPK通路,从而减少炎症介质i NOS和COX-2的表达来实现。4.在大鼠心肌线粒体内膜蛋白中筛选到的差异蛋白——UQCRC1可能是预处理时心肌细胞主动产生内源性保护的靶蛋白。