研究背景白血病细胞耐药是髓性白血病治疗中的一大障碍,是治疗失败的主要原因之一。多药耐药可通过P糖蛋白、多药耐药性相关蛋白、拓扑异构酶Ⅱ、肺抗药性相关蛋白介导的多药耐药基因的表达而改变。进一步研究白血病的化疗耐药机制,寻找新的治疗靶点,增强化疗敏感性、克服耐药,具有十分重要的临床应用价值。代谢组学可对生物或细胞代谢产物进行定性和定量分析,并寻找代谢物与生理病理变化的相对关系,而越来越受到人们的重视。研究者利用代谢组学技术探索格列卫(IM)耐药与敏感的慢粒白血病(CML)细胞的代谢物差异,为IM耐药的治疗提供新靶向和新思路。结果表明：IM耐药与细胞增高的糖酵解活性和磷脂翻转有关；对IM耐药的K562-r和LAMA84-r细胞保持了增高的葡萄糖摄取和乳酸生成的高糖酵解代谢表型。糖酵解活性与肿瘤生成及对放化疗的耐受呈正相关。通过抑制糖酵解酶的活性,可阻断糖酵解的进行,从而使得肿瘤细胞因能量供应缺乏而死亡,但正常细胞不受影响。研究表明,仅依靠抑制有氧糖酵解,并不足以产生显著的具有临床意义的抗肿瘤作用。这可能是由于ATP的耗竭只有达到一定的阈值才能启动细胞的凋亡或坏死程序,最终导致细胞的死亡。近来大规模的基因表达分析表明在造血系统恶性肿瘤中编码糖酵解途径分子的基因选择性表达上调。研究证实在血液肿瘤细胞中,亦存在糖酵解异常现象。3溴丙酮酸(3-BrPA)可有效诱导了多药耐药急性髓系白血病(AML)细胞株HL-60/AR的凋亡,提示阻断细胞的能量供应有可能克服血液肿瘤细胞多药耐药性。泼尼松龙耐药与急性淋巴细胞白血病(ALL)细胞高葡萄糖消耗明显相关,通过抑制糖酵解可使对泼尼松龙耐药的ALL原代细胞和细胞株对糖皮质激素重新敏感,这种增敏作用可通过细胞重要的能量传感系统腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)来调控。糖酵解的抑制可活化AMPK,导致mTOR的抑制,进而使抗凋亡蛋白Mcl-1表达下调。目前尚未有糖酵解抑制剂联合化疗用于髓性白血病化疗增敏的报道。本研究以髓性白血病耐药细胞能量代谢异常作为切入点,采用分子和细胞生物学等方法系统分析研究髓性白血病糖酵解相关分子的表达与耐药形成的关系,以及在体外调控糖酵解对化疗敏感性的影响并探讨其机制,从而为逆转髓性白血病化疗耐受的治疗提供新思路。第一部分糖酵解相关分子表达与髓性白血病化疗敏感性的研究研究目的1.探讨髓性白血病细胞糖酵解活性与化疗耐受的关系。2.探讨髓性白血病细胞糖酵解相关分子的表达与化疗耐受的关系。3.探讨髓性白血病细胞线粒体ATP合成酶的表达与化疗耐受的关系。材料和方法1.细胞培养：对阿霉素(ADM)敏感和耐药AML细胞株(HL-60和HL-60/ADM),以及对IM敏感和耐药CML细胞株(K562和K562-R)均采用含10%FBS的RPMI1640(青霉素100U/ml,链霉素100μ g/m1),置5%CO2培养箱、37℃饱和湿度培养。2.临床标本：54例患者骨髓标本来自南方医院血液科和中山人民医院血液科2010年12月至2011年11月间住院的非M3型AML患者,骨髓白血病细胞≥80%。其中初治45例,复发9例。男31例,女23例,平均年龄41.6±17.8岁。另选取19例健康对照者,男11例,女8例,平均年龄39.2±14.1岁,对照组的年龄、性别构成比与AML病例经卡方检验无明显差异(p>0.05)。3.实验方法：(1)葡萄糖消耗实验检测不同化疗敏感性髓性白血病细胞株糖酵解活性。(2)荧光定量PCR检测不同化疗敏感性髓性白血病细胞(细胞株和AML原代细胞)糖酵解相关基因(HIF-1α、FBP1、HK-Ⅱ和GLUT1) mRNA的表达。(3)酶促法检测不同化疗敏感性AML患者血清LDH含量。(4)流式细胞术检测不同化疗敏感性AML患者白血病细胞CD147的表达。(5)免疫印迹(Western Blot)检测不同化疗敏感性髓性白血病细胞(细胞株和AML原代细胞)线粒体ATP合成酶ATP5B蛋白表达。4.统计分析统计学处理应用SPSS16.0统计分析软件;统计结果用x±s表示;两样本均数比较采用独立样本t检验,多组间样本均数比较用单向方差分析(one-Way ANOVA),若方差齐性,组间差异采用LSD法做多重比较；若方差不齐采用welch法检验,组间差异采用Dunnett’s T3法做多重比较。组间率的比较采用卡方检验。以a=0.05为检验标准,采用双侧检验。p值≤0.05时,认为有显著性差异。结果1.髓性白血病细胞株糖酵解活性与化疗耐受性的关系耐药细胞株HL-60/ADM和K562-R的糖酵解活性均明显高于相对应的化疗敏感细胞株HL-60和K562。2.不同化疗敏感性髓性白血病细胞糖酵解相关基因mRNA的表达(1)髓性白血病细胞株糖酵解相关基因mRNA的表达HIF-1α mRNA和GLUT1mRNA在耐药白血病细胞株HL-60/ADM和K562-R中的相对表达水平较化疗敏感的野生型细胞株HL-60和K562高(p<0.01、p<0.05)。而另一糖酵解关键酶HK-Ⅱ mRNA相对表达水平在HL-60耐药细胞株中明显低于野生株(p<0.01),在K562耐药细胞株中显著高于野生株(p<0.01)。但糖酵解抑制酶FBP1mRNA相对表达水平在HL-60耐药细胞株中明显高于野生株(p<0.01),在K562耐药细胞株中显著低于野生株(p<0.01)。(2) HIF-1α mRNA在不同化疗敏感性AML患者中的表达未缓解(NR)组患者HIF-1α mRNA表达量明显高于对照组、完全缓解(CR)和部分缓解(PR)组,而在对照组、CR和PR组中,HIF-1α mRNA表达量有逐渐升高趋势。(3) FBP1mRNA在不同化疗敏感性AML患者中的表达患者FBP1mRNA表达量个体间差异非常大,经F检验提示各组间无差异(p>0.05)。(4) HK-Ⅱ mRNA在不同化疗敏感性AML患者中的表达NR组患者HK-Ⅱ mRNA表达量明显高于对照组、CR和PR组,而在对照组、CR和PR组中,HK-Ⅱ mRNA表达量有逐渐升高趋势。(5) GLUT1mRNA在不同化疗敏感性AML患者中的表达NR组患者GLUT1mRNA表达量明显高于对照、CR和PR组,而在对照组、CR和PR组中,GLUT1mRNA表达量有逐渐升高趋势。3.不同化疗敏感性AML患者血清LDH的表达NR组患者血清LDH含量明显高于对照、CR和PR组,而在对照组、CR和PR组患者中,血清LDH含量有逐渐升高趋势。4.不同化疗敏感性AML患者CD147的表达化疗NR组AML患者骨髓白血病细胞CD147的表达明显高于CR和PR组。5.不同化疗敏感性髓性白血病细胞线粒体合成酶ATP5B的表达耐药细胞株HL-60/ADM和K562-R的ATP5B蛋白表达水平明显低于相对应的化疗敏感细胞株；化疗NR组AML患者骨髓白血病细胞ATP5b蛋白明显低于CR组,差异有统计学意义(p<0.05)。结论1.化疗耐药髓性白血病细胞株的糖酵解活性均明显高于相对应的化疗敏感野生型细胞株。2. HIF-1α mRNA和GLUT1mRNA在耐药髓性白血病细胞株中的相对表达水平较化疗敏感的野生型细胞株高。3.化疗耐受AML患者骨髓白血病细胞HIF-1α、HK-Ⅱ和GLUT1mRNA表达量明显高于敏感组。4.化疗耐受AML患者骨髓白血病细胞FBP1mRNA表达量与敏感组无差别。5.化疗耐受AML患者血清LDH含量明显高于敏感组。6.化疗耐受AML患者骨髓白血病细胞CD147的表达明显高于敏感组。7.线粒体合成酶ATP5B蛋白表达水平在耐药髓性白血病细胞株中明显低于化疗敏感的野生型细胞株；同样化疗耐受AML患者骨髓白血病细胞ATP5B蛋白表达水平亦明显低于敏感组。第二部分抑制糖酵解对髓性白血病化疗耐受的影响及机制研究目的1.探讨抑制糖酵解对髓性白血病细胞株化疗耐受性的影响。2.探讨改变糖酵解活性影响髓性白血病细胞株化疗敏感性的可能机制。材料和方法1.细胞培养：对ADM敏感和耐药AML细胞株(HL-60和HL-60/ADM),以及对IM敏感和耐药CML细胞株(K562和K562-R)均采用含10%FBS的RPMI1640(青霉素100U/ml,链霉素100μ g/m1),置5%CO2培养箱、37℃饱和湿度培养。2.实验方法：(1)台盼蓝染色计数法检测细胞活力取指数生长期细胞(HL-60、HL-60/ADM、K562和K562-R),处理组分别加入不同浓度药物(糖酵解抑制剂、化疗药、糖酵解抑制剂+化疗药),培养3d,每天计数活细胞数目(台盼蓝拒染)。采用Weeb系数检验糖酵解抑制剂联合化疗药是否具有协同效应。(2)MTT法检测细胞活力取指数生长期细胞(HL-60、HL-60/ADM、K562和K562-R),处理组分别加入不同浓度药物(糖酵解抑制剂、化疗药、糖酵解抑制剂+化疗药),培养3d,MTT实验检测细胞活力。采用Weeb系数检验糖酵解抑制剂联合化疗药是否具有协同效应。(3)葡萄糖消耗实验检测不同化疗敏感性髓性白血病细胞株糖酵解活性。将106个不同处理组白血病细胞(HL-60、HL-60/ADM、K562和K562-R)置入无血清RPMI1640中,培养4d,收集细胞上清。按照Glucose (HK) Assay试剂盒说明,在波长340nm处观察其吸光度,并计算溶液中的葡萄糖含量。(4) Annexin V/PI双染色法检测细胞凋亡将106个不同处理组白血病细胞(HL-60、HL-60/ADM、K562和K562-R)培养1d后,采用流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡情况。(5)RNA干扰HIF1α或GLUT1基因后检测耐药AML细胞化疗敏感性的变化首先设计针对靶基因HIF1P或GLUT1的shRNA序列,通过电转染实验对耐药细胞株HL-60/ADM进行转染,再通过荧光定量PCR和Western Blo检测RNA干扰效果,从而筛选shRNA靶序列。将shRNA序列利用酶切、连接等基因重组技术构建到慢病毒载体pLVX-shRNA1上,然后转染Lenti-X293T细胞进行病毒包装,将包装好的病毒感染HT-1080细胞进行病毒滴度测定；同时用病毒感染HL-60/ADM细胞后检测RNA干扰效果。将包装好的病毒感染HL-60/ADM细胞,通过嘌呤霉素筛选3次后建立稳定表达pLVX-shRNAl-HIFlα和pLVX-shRNAl-GLUTl的HL-60/ADM细胞株。然后,通过MTT法检测经不同浓度组ADM处理后这些细胞株的存活率。3.统计分析统计学处理应用SPSS16.0统计分析软件;统计结果用x±s表示;两样本均数比较采用独立样本t检验,多组间样本均数比较用单向方差分析(one-Way ANOVA),并进行方差齐性检验,与对照组比较用Dunnett-t法检验。组间率的比较采用卡方检验。以a=0.05为检验标准,采用双侧检验。p值≤0.05时,认为有显著性差异。结果1.抑制糖酵解对髓性白血病细胞株增殖的影响台盼蓝染色法和MTT法结果显示,糖酵解抑制剂2-DG或3BrPA联合ADM对耐药细胞株HL-60/ADM具有显著协同作用,而对野生细胞株HL-60不具有协同作用。同样,2-DG或3BrPA联合IM对耐药细胞株K562-R具有显著协同作用,而对野生细胞株K562不具有协同作用。2.抑制糖酵解对不同化疗敏感性髓性白病细胞株糖酵解活性的影响糖酵解抑制剂2-DG或3BrPA单独或联合细胞毒药物使用均可显著降低HL-60和K562敏感和耐药细胞株葡萄糖的消耗,而单独使用细胞毒药物,葡萄糖消耗的减少不明显。3.抑制糖酵解对不同化疗敏感性髓性白血病细胞凋亡的影响糖酵解抑制剂2-DG或3BrPA单独或联合化疗药处理HL-60、HL-60/ADM、K562和K562-R细胞24h后,细胞凋亡率无明显差别；而联合处理明显提高了这些细胞的坏死率。4. siRNA沉默HL60/ADM细胞HIF1P或GLUT1基因表达后化疗敏感性改变构建了稳定表达pLVX-shRNA1-HIFlα和pLVX-shRNA1-GLUT1的HL-60/ADM细胞株。MTT结果显示,稳定表达pLVX-shRNAl1HIF1α的HL-60/ADM细胞对ADM的化疗敏感性无明显改变,而稳定表达pLVX-shRNA1-GLUT1的HL-60/ADM细胞对ADM的化疗敏感性明显提高。结论1.糖酵解抑制剂2-DG或3BrPA通过抑制葡萄糖消耗可增强ADM对化疗耐药细胞药敏性；同样,2-DG或3BrPA联合IM对K562-R细胞具有协同杀伤作用。2.2-DG或3BrPA对髓性白血病细胞的化疗毒性增强作用主要依赖于非凋亡的细胞死亡途径。3.RNA干扰沉默GLUT1基因可提高HL-60/ADM细胞对ADM的敏感性,而HIF-1P基因沉默未能明显提高提高HL-60/ADM细胞对ADM的敏感性。