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骨关节炎(Osteoarthritis, OA)是一种多因素所致的慢性进行性疾病，诸多因素在其发生及发展的过程中起着重要的作用。研究表明，血管细胞粘附分子-1(Vascularcell adhesion molecule1，VCAM-1)可能在骨关节炎的发病中扮演着重要的角色，但其具体作用机制尚未明确。目的本研究首先通过酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)及VCAM-1单克隆抗体的免疫组织化学染色，对正常人及骨关节炎患者的血清、关节滑膜及软骨组织中的VCAM-1进行测定并比较。其次研究人正常软骨细胞与骨关节炎软骨细胞的体外分离、培养及鉴定，对其生物学特性进行对照并评价其生物学活性，为进一步研究人软骨细胞的其他生物学特性及骨关节炎的发病机制提供实验基础。并且通过RT-PCR及Westernblot实验，从细胞的基因及蛋白水平对所获得的人正常及骨关节炎软骨细胞的VCAM-1的表达进行比较，并对不同浓度IL-1β作用下人正常软骨细胞的VCAM-1的表达进行比较，初步探讨VCAM-1在骨关节炎发病机制中的作用，为进一步揭示VCAM-1在骨关节炎发病中的具体作用机制提供实验依据。方法1．采用ELISA法分别对正常人及骨关节炎患者血清中的VCAM-1的表达进行测定；对正常及骨关节炎患者的关节滑膜及软骨组织进行VCAM-1单克隆抗体免疫组织化学染色。2．取人创伤性截肢的正常无菌膝关节软骨与骨关节炎全膝置换的膝关节软骨，采用两步酶消化法分离得到软骨细胞，分别进行体外培养并传代。通过倒置相差显微镜下观察细胞形态，绘制生长曲线，测细胞增殖，甲苯胺蓝染色及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色对各代人正常软骨细胞与骨关节炎软骨细胞进行鉴定。3．通过RT-PCR检测VCAM-1mRNA以及Western blot检测VCAM-1蛋白，对所获得的人正常及骨关节炎软骨细胞中VCAM-1的表达进行比较。4．通过RT-PCR及Western blot实验，从细胞的基因及蛋白水平对不同浓度IL-1β作用下人正常软骨细胞的VCAM-1的表达进行比较。结果1．各级骨关节炎患者的血清中VCAM-1的表达量都明显高于正常对照组(P<0.05)。并且随着骨关节炎程度的加重而增高。2．骨关节炎患者的关节滑膜及软骨组织中VCAM-1单克隆抗体免疫组织化学染色呈阳性，且随着病变程度的加重，着色加深。各级骨关节炎患者关节软骨中VCAM-1的表达都明显高于正常对照组(P<0.05)，而且骨关节炎患者各级间VCAM-1的表达也具有统计学差异(P<0.05)，表明VCAM-1的表达量也随着骨关节炎程度的加重而增高。3．经过两步酶消化法分离的原代正常软骨细胞为球形，培养2-3天，细胞贴壁、变形，呈三角形或多角形，1周后细胞增殖明显，约2周左右，细胞融合成层。传代后第1代细胞贴壁时间较原代细胞短，增殖速度加快。但随传代次数增加，增殖速度渐减慢，细胞形态逐渐向“纤维样”细胞转化。而骨关节炎软骨细胞形态似成纤维细胞，生长速度明显较正常软骨细胞慢。4．MTT实验结果显示，正常软骨细胞5代以内的生长曲线呈“S”型。而骨关节炎软骨细胞增殖低于正常组，传至第4代其生物学特征已基本消失。5．甲苯胺蓝染色显示，正常软骨细胞内可见蓝紫色异染颗粒，细胞周围有少量的异染颗粒出现。经多次传代培养后，软骨细胞甲苯胺蓝染色正染呈浅蓝色。而骨关节炎软骨细胞以正染蓝色为主，经多次传代后细胞基本无蓝色。6．Ⅱ型胶原免疫组织化学染色显示，正常原代软骨细胞着色为棕黄色，呈阳性，细胞核周围呈黄褐色，可见黄褐色颗粒在细胞周围。细胞经传代后棕黄色着色渐减弱，5代以后软骨细胞呈成纤维化，突起增多，染色变淡。而骨关节炎软骨细胞原代染色为棕黄色，经多次传代后基本无棕黄色着色。7．所获得的人骨关节炎软骨细胞中VCAM-1mRNA的量及蛋白的表达量明显较正常软骨细胞高。8．IL-1β干预组的人正常软骨细胞中VCAM-1mRNA的量以及VCAM-1的蛋白量表达明显高于空白对照组，且随IL-1β浓度增加，其亦有增高的趋势。结论1．血清、关节滑膜及软骨组织中VCAM-1的表达与骨关节炎密切相关，且随病变的加重其表达量增加。2．采用胰蛋白酶及Ⅱ型胶原酶联合消化法可以获得人正常及骨关节炎关节软骨细胞。正常软骨细胞5代以内细胞生长良好，生物学特性明显，适合于实验研究，5代以后出现去分化现象；骨关节炎软骨细胞增殖慢，生物学特征退变早，符合软骨细胞退变的表现。这为骨关节炎软骨细胞水平的研究提供了实验基础。3．人骨关节炎软骨细胞VCAM-1的表达明显高于正常软骨细胞，证实了本研究中所获得的细胞具有代表性，可以作为后续研究骨关节炎发病机制中的模型细胞，为下一步揭示VCAM-1在骨关节炎发病中的具体作用机制提供了实验依据。4．IL-1β干预组的人正常软骨细胞中VCAM-1的表达明显高于空白对照组，且随IL-1β浓度增加，其亦有增高的趋势。这一结果证实了VCAM-1的表达与导致骨关节炎的细胞因子有相关性，印证了VCAM-1作为骨关节炎风险预测因子的可靠性，初步探讨了VCAM-1在骨关节炎发病机制中的作用。