细胞凋亡是细胞的程序性死亡过程,有利于维持生物体的内环境稳态。Bcl-2(B-cell lymphoma2)家族蛋白作为线粒体调亡途径中的调控者,扮演了至关重要的角色。家族中的抗凋亡蛋白与促调亡蛋白通过保守的BH(Bcl-2homology)3结构域相互作用决定着细胞的命运。研究发现,当细胞内的抗凋亡蛋白过量表达时,会使细胞逃避调亡,获得永生,这也是多种肿瘤发生和发展的重要原因之一。因此,以抗调亡蛋白为靶点,促进其降解或者下调其功能,成为肿瘤治疗的新的策略。Mule(Mcl-l ubiquitin ligase E3),是最新发现的BH3-only蛋白。它能够通过保守的BH3结构域特异地结合Bd-2家族的重要抗调亡成员之一,Md-l(myeloid cell leukaemia 1)蛋白,使其泛素化从而被蛋白酶体降解。但是,二者发生相互作用的结构基础尚未解析。S1-16是本课题组设计合成的BH3功能模拟分子,己经通过细胞生物学实验,从功能上证明它能够结合Mcl-l蛋白的活性位点:BH3沟槽,从而抑制其抗调亡功能。但是,S1-16与Md-1蛋白相结合的结构信息尚不充分。本研究以Mcl-l蛋白为对象,以获得Mcl-l蛋白与Mule BH3肽段以及Mcl-l蛋白与S1-16的共结晶晶体为目标,解析晶体结构,从空间结构水平分析它们的作用机制。本研究将为新一代Mcl-l抑制剂类BH3功能模拟分子的设计和优化提供结构依据。首先,对Mcl-l蛋白进行重组表达。使用E.coli表达系统,转入含有目的基因的质粒,经诱导表达及纯化条件的优化,最终获得纯度达到95%以上的Mcl-l蛋白。随后,通过ITC实验和NMR实验,证明了Md-1蛋白的活性和空间结构的折叠正常。这些结果表明,表达纯化的Md-1蛋白满足结构生物学的研究需要。接下来,对Mcl-l蛋白和MuleBH3肽段进行共结晶实验。基于气相扩散法的原理,采用坐滴法,对结晶条件、试剂进行筛选和优化,获得了满足X-射线衍射要求的晶体,衍射数据达到2.05 A,解析得到Mcl-l蛋白与Mule BH3肽段复合物的空间结构。经分析发现,Mule BH3肽段上位于α螺旋一个侧面的四个氨基酸残基,插入到Md-1蛋白BH3结构域的疏水沟槽中。此外,MuleBH3肽段上一个保守Asp残基与Mcl-l蛋白BH1结构域上的Arg263残基形成盐桥。首次在结构水平上证实了Mule与Mcl-l蛋白的作用机制。之后,尝试获得Md-1蛋白与BH3功能模拟分子S1-16的共结晶晶体。在蛋白晶体浸泡法失败后,继续采取坐滴法进行共结晶实验,得到了蛋白晶体,为结晶条件的进一步优化奠定了基础。综上所述,本研究首次得到了Mcl-l蛋白与Mule BH3肽段复合物晶体,并从结构水平分析了二者的作用机制,为设计能够促进Mcl-l蛋白泛素化降解或抑制其功能的BH3模拟子提供了结构依据。此外,还初步筛选到了Mcl-l蛋白与S1-16共结晶的条件,为后续的优化奠定了基础。