蛋白质组学通过规模化分析鉴定从有机体细胞或者组织中提取的蛋白质,从而获得蛋白质组成、表达、修饰和定量信息。蛋白质组深度覆盖研究在蛋白质组学的研究中占据重要部分,有助于对生命体复杂生理功能和病理变化的全面认识和深入了解。但是,目前质谱仪器在检测灵敏度和扫描速度等方面的局限性,以及蛋白质组样品的复杂多样性和极宽的丰度范围,都极大的限制了对许多疾病的发生、发展起关键作用的低丰度蛋白质的鉴定。常用的低丰度蛋白质富集策略在富集的广谱性和研究通量等方面均存在一定缺陷。而经典的蛋白质分离技术虽然能够在一定程度上降低样品的复杂程度,但并不能提高低丰度蛋白质在样品中的含量,因而在提高低丰度蛋白质的鉴定覆盖率上效果有限。基于上述原因,发展快速、高效的低丰度蛋白质富集方法,提高其在样本中的含量,是实现其高灵敏度鉴定和分析的重要前提。因此,发展新型低丰度蛋白质富集鉴定策略成为目前蛋白质组学新方法领域的热点之一。在生物体内,RNA与蛋白质基于特殊序列和空间结构等发生特异性结合,在细胞功能和基因表达中起着关键调节作用。基于此,本论文第一部分发展了一种基于RNA-蛋白质相互作用的低丰度蛋白质富集亲和试剂。我们首先设计合成了特定序列的RNA探针,利用蛋白质与RNA探针之间的特异性相互作用,提取RNA-蛋白质复合物、酶解,进行液相色谱-质谱联用鉴定,质谱结果进行搜库,得到RNA-蛋白质数据。然后将所得RNA-蛋白质数据结果按照设计的数据分析流程：数据预处理、数据标准化、缺失值填充、数据质控、RNA-蛋白质相互作用筛选和RNA特异性结合蛋白质筛选,进行数据统计分析,从而筛选出与RNA亲和探针特异性结合的低丰度蛋白质。基于此研究策略,我们合成了53条RNA探针,用以富集小鼠肝脏细胞核蛋白质。基于理论数据库检索,53条RNA分别能够获得507-1268种细胞核蛋白。通过数据分析,53条RNA分别含有142-478个RNA-蛋白质相互作用,合计共511个非冗余的RNA-蛋白质相互作用。通过对所得的RNA-蛋白质相互作用进行进一步筛选,最终挖掘出与每条RNA探针特异性结合的低丰度蛋白质。从53条RNA的富集产物中共得到132个RNA序列依赖的特异性结合低丰度蛋白质。对132个特异性结合蛋白进行生物信息功能分析,结果表明所富集的低丰度蛋白质功能大多与RNA相关,这证明本研究发展的RNA亲和试剂筛选新方法可以成功实现低丰度蛋白质的富集鉴定,可以对低丰度蛋白质进行广谱性和高效性富集。这一研究策略在一定程度上提高了目前蛋白质组的鉴定覆盖水平,为蛋白质组学深度乃至全面覆盖研究提供了新技术。基于生物质谱的“鸟枪法”策略是目前应用最广泛的蛋白质组研究策略,该策略是基于对蛋白质酶解后的肽段产物进行质谱分析,从而获得相应的蛋白质信息。因此,如何高效、完全地实现蛋白质酶解便成为蛋白质组学技术研究的另一热点,也是样品处理通量受到限制的关键。与“鸟枪法”中常用的溶液酶解方法相比,固定化酶解技术具有酶解时间短、产物易分离、酶可重复利用等多种优势,引起了广泛关注。但是,目前研究中使用的固定化酶试剂多采用固相载体材料,固定化酶与底物蛋白质在异相体系中进行酶解反应。固液界面固有的传质阻力和空间位阻,限制了酶与底物的有效接触,因此限制了固定化酶解效率的进一步提高。在论文的第二部分,我们利用温度敏感聚合物对外界温度变化的响应能力,制备了一种基于可溶性温敏聚合物的新型固定化胰蛋白酶试剂,并将其应用在蛋白质组学研究中。该固定化酶具备的温度敏感特性,使其在体系温度高于温敏聚合物的最高临界溶解温度(Upper Critical Solution Temperature, UCST)时处于溶解状态,其与蛋白质样本形成均相体系,不存在传质阻力,并降低了空间位阻,因此有效提高了固定化酶与蛋白质底物的碰撞几率,提升了酶解效率；当体系温度低于其UCST时,固定化胰蛋白酶试剂团聚、析出成沉淀,便于与酶解产物的分离以及酶的简便回收,从而实现了“高温均相酶解,低温异相分离”。使用标准蛋白对固定化酶的酶解效率、完全性和稳定性等指标进行了考察,同一固定化酶重复酶解牛血清白蛋白15次,1 min固定化酶解产物肽段的氨基酸序列覆盖率在82%到94%之间,均高于传统溶液酶解12h所得74%的覆盖率,表明该固定化酶试剂取得了良好效果。此外,本研究制备的固定化酶成功应用于宫颈癌细胞全蛋白质组的快速、高效酶解,其1 min固定化酶解效果相当于相同条件下溶液酶解12h的酶解效果。该固定化酶试剂显著缩短了蛋白质酶解所需时间,且固定化酶利用“高温均相酶解,低温异相分离”的特点,实现了酶的重复利用,避免了酶的自切。总之,该固定化酶试剂提高了蛋白质组样品的处理通量,本研究结果充分证明温敏型聚合物在蛋白质组学研究中的应用潜力。本课题针对当前蛋白质组学研究中存在的蛋白质组鉴定覆盖深度有限以及蛋白质组样本处理通量偏低,这两个重要的研究难点和技术瓶颈,提出并发展了基于新型亲和富集试剂和固定化酶解试剂的研究新策略,为蛋白质组学研究向高灵敏度、高通量方向发展提供了支撑。