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精斑的鉴定是法医学的一个经典课题。在强奸、猥亵等性侵害案件中，精斑或混合斑往往成为决定性的证据，对于揭露犯罪、证实犯罪意义非常重大。对精斑的确证是证据链中不可缺少的一环。
传统的精斑确证依赖细胞学检测或免疫学方法，在灵敏度、特异性、实用性等方面均存在着一些缺陷，仍有改进的必要。本课题从基因表达的组织特异性方向入手，选择精斑特异性的mRNA标记(PRM2、KLK3)及microRNA标记(miR10b、miR135b)，建立基于实时荧光定量PCR(real time quantitative PCR，RT-qPCR)技术的精斑确证方法。
用TRIzol法提取体液斑总RNA后，用无RNAse的DNAse进行DNA污染的消化，用M-MLV酶进行逆转录，产物用于RT-qPCR检测。应用特异性引物及TaqMan探针检测上述RNA标记在精斑及其他常见法医学体液斑检材(外周血痕、月经血痕、阴道分泌物斑痕)中的表达水平，根据表达差异建立精斑确证的阴阳性标准，并评估mRNA及microRNART-qPCR精斑确证体系的效能。
mRNART-qPCR法确证精斑的阴阳性标准如下：(1)同时达到如下标准可确证为精斑：①目的基因PRM2、KLK3及内参基因ACTB在荧光检测阈值设置为0.02时均可检测到确定的CT值，CT＜35；②ΔCT[P2-A]＜-2；⑨ΔCT[K3-A]＜0。(2)同时达到如下标准为无精子精斑：①目的基因PRM2、KLK3及内参基因ACTB在荧光检测阈值设置为0.02时均可检测到确定的CT值，CT＜35；②-2≤ΔCT[P2-A]≤2；③ΔCT[K3-A]＜0。(3)出现以下任一结果时认为检测失败，RNA提取不成功或已降解：①内参基因ACTB在荧光检测阈值设置为0.02时，扩增曲线与阈值线无交点，CT值显示为“Undetermined”；②内参基因ACTB在荧光检测阈值设置为0.02时，可以检测到确定的CT值，但CT≥35。
mRNART-qPCR精斑确证体系对正常精斑的确证阳性率为93.33％，假阴性率为6.67％，假阳性率为0；对无精子精斑的确证阳性率为100％，假阴性率为0，假阳性率为3.33％。mRNART-qPCR精斑确证体系的检测灵敏度可达1ng级。
miRNART-qPCR法确证精斑的阴阳性标准如下：(1)同时达到如下标准可确证为精斑：①microRNA标记miR10b、miR135b及内参RNU6b在荧光检测阈值设置为0.04时均可检测到确定的CT值，CT＜40；②ΔCT[10b-U6]＜-5.5；③ΔCT[135b-U6]＜-6。(2)出现以下任一结果时认为检测失败，RNA提取不成功或已降解：①内参RNU6b在荧光检测阈值设置为0.04时，扩增曲线与阈值线无交点，CT值显示为“Undetermined”；②内参RNU6b在荧光检测阈值设置为0.04时，可以检测到确定的CT值，但CT≥40。
miRNART-qPCR精斑确证体系对精斑的确证阳性率为88.57％，假阴性率为11.43％，假阳性率为6.67％。
miRNA RT-qPCR精斑确证体系的检测灵敏度达10ng级。
应用终点定量PCR(endpoint PCR，EP-PCR)复合扩增技术，建立精斑与法医学中另外两种常见体液斑外周血痕及月经血痕的特异性mRNA标记的复合检测体系。复合扩增体系包括精斑特异性mRNA标记PRM2、KLK3，血痕特异mRNA标记HBA，月经血痕特异性标记MMP7、MMP11，以及内参基因ACTB。用此6复合扩增体系检测体液斑样本，获得清晰的检测结果。
以毛细管电泳检测结果为准，制定精斑确证的阴阳性标准如下：(1)mRNA标记PRM2、KLK3及ACTB的产物峰均存在且峰高＞200RFUs，可确证为精斑；(2)KLK3及ACTB的产物峰均存在且峰高＞200RFUs，PRM2产物峰不存在或存在但峰高≤200RFUs时，可能为无精子精斑；(3)ACTB的产物峰存在且峰高＞200RFUs，PRM2及KLK3产物峰均不存在或存在但峰高≤200RFUs时，排除精斑；(4)ACTB的产物峰不存在或存在但峰高≤200RFUs时，RNA提取失败或降解导致检测失败。EP-PCR复合体系进行精液斑确证的灵敏度可达0.1ng总RNA。
与精斑确证常用的P30金标试纸条相比，本研究针对mRNA标记(PRM2及KLK3)和microRNA标记(miR10b及miR135b)所建立的RT-qPCR和EP-PCR复合扩增检测体系均可同时提取检材RNA和DNA，同步进行精斑的定性和定型分析，所用仪器设备和技术平台相同，具有可自动化的潜力，适于法医实践工作需要。
结论：本实验选择的mRNA标记(PRM2及KLK3)和microRNA标记(miR10b及miR135b)在精斑中的表达较其他体液斑高，可以较好的区分精斑及其他体液斑，在法医学精斑确证方向有良好的应用前景。本实验建立的mRNART-qPCR精斑确证体系、microRNART-qPCR精斑确证体系均具有较好的灵敏度，用于精斑确证的效能可满足法医学精液斑确证要求，自动化程度高，具有客观的阴阳性判断标准。本实验建立的体液斑特异性mRNA标记6复合扩增体系可获得清晰、特异、稳定的检测结果，灵敏度高，可用于法医学体液斑确证。