禽白血病病毒J亚群(ALV-J)作为一种致瘤性反转录病毒,在临床上常造成被感染鸡出现持续性病毒血症,并伴随慢性炎症、免疫抑制和肿瘤多样化,其主要原因是病毒严重损害和抑制了机体的免疫应答机能。ALV-J的广泛流行及间歇性爆发给我国乃至世界养鸡产业造成了巨大的经济损失。调查显示,无疫苗的免疫抑制性病毒感染在动物及人群中广泛存在,遗憾的是,其防控方法或手段却依然贫乏。因此,鉴于免疫抑制病毒疫苗研发的失败,探索和开发有效的抗免疫抑制性病毒的药物对于防控此类病毒引发的疾病至关重要。宿主天然防御因子是机体抵抗外来病原体入侵的重要防线,CCCH型锌指抗病毒蛋白(CCCH-ZAP),作为一种新发现的宿主天然防御因子,可通过捕获目标病毒的RNA并介导其降解发挥抗病毒作用。然而有关CCCH-ZAP抗病毒的研究依旧存在很大局限性,一是CCCH-ZAP抗病毒谱仍然停留在哺乳动物且基本均为体外研究,而面对其他物种病毒如禽白血病病毒以及处于机体复杂的体内环境中CCCH-ZAP能否发挥抗病毒活性并不清楚;二是对于CCCH-ZAP抗病毒途径认识还不够全面,仅从蛋白与核酸的互作角度揭示了其作用机制,而CCCH-ZAP与靶病毒蛋白之间的关系如何、是否参与了更重要的体内抗病毒途径也有待探究。本实验室在前期研究中发现,ALV-J感染鸡体内CCCH-ZAP显著高表达,提示CCCH-ZAP可能在ALV-J感染过程中发挥重要作用。基于此发现,本研究以ALV-J为免疫抑制性病毒模型,利用病理学、分子生物学和免疫学等方法研究CCCH-ZAP在体内外对ALV-J的抗病毒能力及其作用机制,以期为防控该病和发现有效的新型抗免疫抑制性病毒药物提供科学依据和技术支持。为探究CCCH-ZAP体外对ALV-J的抗病毒活性,首先利用荧光定量PCR和Western blot检测,结果发现,CCCH-ZAP在ALV-J感染DF-1细胞中的表达显著上调。分别对DF-1细胞中的CCCH-ZAP进行过表达和基因沉默并感染ALV-J后,检测发现CCCH-ZAP的过表达可显著抑制ALV-J复制,反之,当对内源性CCCH-ZAP基因沉默后,ALV-J复制则显著增强。激光共聚焦和免疫共沉淀技术检测结果表明,CCCH-ZAP和ALV-J囊膜蛋白(surface protein,SU)共定位于细胞核周围的胞浆中且存在直接的蛋白互作关系。结果证明CCCH-ZAP是病毒诱导性蛋白,其除了通过降解目标病毒RNA外,还可通过绑定病毒蛋白元件抑制病毒复制。为明确体内CCCH-ZAP表达是否受ALV-J感染影响,通过腹腔注射ALV-J建立ALV-J感染实验动物模型,经荧光定量PCR、免疫组织化学和激光共聚焦技术检测,结果显示ALV-J感染后,脾脏和法氏囊这两种免疫器官中的内源性CCCH-ZAP表达极显著上调,且CCCH-ZAP表现出了向细胞核周围迁移和聚集的现象。以上结果提示,CCCH-ZAP在ALV-J感染中具有独特的抗病毒免疫应答和病毒诱导表达的组织特异性。为进一步探究CCCH-ZAP的体内抗病毒活性,首先建立CCCH-ZAP转基因鸡模型。通过鸡胚卵黄囊注射CCCH-ZAP慢病毒重组过表达载体,利用活体GFP荧光信号成像分析技术和荧光定量PCR技术动态监测鸡体内CCCH-ZAP过表达状态。结果显示,体内CCCH-ZAP过表达主要集中于脾脏和法氏囊中,与ALV-J感染后组织中CCCH-ZAP表达水平相一致,而其余组织中GFP信号微弱,这表明,在ALV-J诱导下,体内CCCH-ZAP过表达主要倾向于免疫器官或免疫细胞中。荧光定量PCR和Western blot检测结果显示,CCCH-ZAP过表达显著抑制了ALV-J复制;病理组织学研究结果进一步证实,CCCH-ZAP过表达显著减轻了ALV-J对机体如肝脏的组织损伤。为探究CCCH-ZAP在体内选择性地过表达于免疫器官后的分布状态,利用荧光显微镜进行观察,结果发现,CCCH-ZAP选择性地分布在脾脏红髓和边缘区以及法氏囊淋巴滤泡皮质区;血像观察结果发现,CCCH-ZAP主要分布于淋巴细胞中,且ALV-J感染使CCCH-ZAP过表达组中GFP阳性细胞比例显著增加。流式细胞术检测结果表明,这些GFP荧光阳性的细胞为T细胞,且CCCH-ZAP过表达增加了免疫器官中T细胞的数量,主要为GFP~+CD3~+双阳性T细胞,但对B细胞的数量无显著影响。为进一步验证CCCH-ZAP对T细胞增殖后分化的影响,体外实验利用CCK-8细胞增殖检测方法对CCCH-ZAP过表达状态下ALV-J感染后的T细胞增殖进行检测,结果发现,CCCH-ZAP过表达使感染ALV-J的T细胞的增殖能力恢复正常,证实了CCCH-ZAP体内外均能够促进T细胞增殖且体外实验发现CCCH-ZAP可减轻ALV-J感染对T细胞增殖的抑制。外周血血清的ELISA检测结果显示,CCCH-ZAP过表达显著促进了病毒感染后IL-2、IL-4和IL-21的分泌水平;不同的是,IL-10的分泌水平显著下降且IFN-γ的分泌水平无显著变化;抗ALV-J抗体检测显示,CCCH-ZAP过表达促进了抗ALV-J抗体的产生。为进一步明确CCCH-ZAP对T细胞的激活作用,利用流式细胞术等方法检测发现,CCCH-ZAP过表达促进了T细胞中IL-2转录水平的上调,并且显著提高IL-2阳性细胞比例;CCCH-ZAP的过表达解除了ALV-J感染对IL-2分泌水平的抑制;并且Western blot检测结果显示,CCCH-ZAP过表达促进T细胞内重要转录激活因子NFAT的活化形成核转位,表明CCCH-ZAP过表达激活T细胞和促进细胞因子的分泌是通过活化NFAT实现的。以上结果说明,CCCH-ZAP通过解除ALV-J对T细胞活化的抑制激活T细胞,进而间接促进抗病毒抗体的产生达到抑制病毒复制的目的,并且这一途径独立于经典干扰素通路。为了探究CCCH-ZAP对T细胞产生抗病毒免疫反应的影响,通过对MSB-1细胞中的内源性CCCH-ZAP进行基因沉默检测ALV-J感染后T细胞的免疫应答和活化增殖能力。结果显示,经CCCH-ZAP基因沉默后T细胞中的病毒滴度显著上升,且ALV-J转录水平和蛋白水平均显著升高。此外,经CCCH-ZAP基因沉默的MSB-1细胞对刀豆蛋白ConA刺激的应答能力显著降低,Western blot检测发现CCCH-ZAP基因沉默促进了NFAT的磷酸化。以上结果表明,CCCH-ZAP基因沉默显著降低了T细胞的抗病毒免疫应答能力,且对NFAT的激活至关重要。为探究CCCH-ZAP解除ALV-J抑制T细胞活性进而激活T细胞的分子机制,进一步利用蛋白质组学技术分析ALV-J感染后CCCH-ZAP过表达影响的细胞内差异表达蛋白,筛选到与T细胞激活密切相关的关键蛋白类Norbin蛋白(NLP)和蛋白激酶Cδ亚型(PKC-δ)。为验证NLP和PKC-δ在CCCH-ZAP过表达激活T细胞免疫应答能力中的分子机制,首先在MSB-1细胞上过表达NLP和CCCH-ZAP,ALV-J感染后的Western blot检测发现,NLP与SU之间存在蛋白互作,而CCCH-ZAP的过表达会与NLP竞争性结合SU。通过磷酸酶活性检测发现,ALV-J感染可显著抑制NLP的磷酸酶活性,而CCCH-ZAP的过表达解除了ALV-J对NLP磷酸酶活性的抑制。以上结果表明,CCCH-ZAP可通过竞争性结合SU释放NLP受ALV-J抑制的磷酸酶活性。为验证NLP对PKC-δ的靶向性,在MSB-1细胞上过表达NLP,Western blot检测结果显示,NLP的过表达显著降低了PKC-δ总蛋白和磷酸化蛋白水平,并且促进了PKC-δ膜质转位,从而降低PKC-δ活性。为进一步明确NLP是否参与CCCH-ZAP对PKC-δ的调控,在MSB-1细胞上过表达CCCH-ZAP并对NLP进行基因沉默,Western blot检测结果显示CCCH-ZAP过表达可显著降低PKC-δ总蛋白和磷酸化蛋白水平,但是NLP基因沉默则消除了这一影响。以上结果说明NLP是CCCH-ZAP调节PKC-δ的关键因子。随后,为探究PKC-δ与NFAT之间的关系,对MSB-1细胞中内源性PKC-δ进行基因沉默。Western blot检测发现PKC-δ基因沉默显著降低NFAT磷酸化水平,并且促进了NFAT核转位。当对MSB-1细胞过表达PKC-δ且利用rotterin抑制PKC-δ磷酸化后发现NFAT磷酸化水平仍然显著降低。以上结果表明,PKC-δ在磷酸化活化状态发挥蛋白激酶活性,维持NFAT在细胞静息状态下的磷酸化水平;PKC-δ的去磷酸化状态会促使NFAT磷酸化水平降低,促进NFAT核转位,进而激活T细胞。综上所述,本研究发现CCCH-ZAP不仅可以通过识别并绑定病毒蛋白元件发挥抗病毒作用,还可以在病毒诱导后通过选择性地在免疫器官中表达特异性促进T细胞增殖进而调节宿主抗病毒免疫反应。更重要的是,CCCH-ZAP能够通过竞争结合的方式使ALV-J囊膜蛋白SU从NLP上脱离来释放NLP的活性,从而解除ALV-J造成的免疫抑制,恢复T细胞对外来病原体的免疫反应能力。CCCH-ZAP多渠道抗病毒方式及机制的揭示为宿主天然防御因子的抗病毒研究提供了新思路,也为免疫抑制性病毒的防控提供新的科学基础和理论依据。