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天青蛋白是由假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)分泌的一种螯合了铜离子的小分子蛋白,由128个氨基酸组成,分子量为14.6kDa,在生物体内起到氧化还原和电子传递的作用。但近几年的研究发现天青蛋白具有抗肿瘤作用,它可以与肿瘤抑制蛋白p53形成复合物,从而稳定和提高p53蛋白在细胞内的水平,然后通过半胱氨酸蛋白酶介导的线粒体途径诱导细胞凋亡。现已有文献报道天青蛋白能够抑制裸鼠网状瘤J774巨噬细胞的增殖,诱导黑色素瘤UISO-Mel-2细胞、人乳腺癌MCF-7、人骨肉瘤U2OS细胞的凋亡。本研究从恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida KT2440)中PCR扩增出天青蛋白基因,利用Red/ET同源重组技术分别构建了大肠杆菌α-溶血素Ⅰ型和融合了胡萝卜软腐欧文氏菌果胶酶pelB基因信号肽的Ⅱ型天青蛋白分泌表达载体,分别转入大肠杆菌BL21(DE3),用四环素诱导表达。序列比对结果表明,来源于恶臭假单胞(Pseudom-onas putida KT2440)和绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa PAO1)的天青蛋白基因具有81%的序列同源性。经SDS-PAGE和Western Blot检测比较,天青蛋白基因在大肠杆菌Ⅱ型分泌表达载体中能够高效分泌表达。通过镍柱亲和层析的方法纯化大肠杆菌Ⅱ型分泌系统上清中的天青蛋白,SDS-PAGE证明天青蛋白得到了很好的纯化,用纯化的蛋白作用于小鼠黑色素瘤B16细胞和小鼠乳腺癌4T1细胞,MTT检测表明纯化后的天青蛋白对B16细胞和4T1细胞都具有较强的抑制作用,通过琼脂糖凝胶电泳可见典型的DNA Ladder条带,证明天青蛋白的作用导致了这两种细胞的凋亡。本文成功构建了能够高效分泌表达天青蛋白的大肠杆菌Ⅱ型分泌表达载体并用小鼠肿瘤细胞验证了天青蛋白的抗肿瘤作用,为进一步研究天青蛋白的抗肿瘤作用奠定了基础,为探索小分子蛋白的表达提供了新的基因重组技术。