华支睾吸虫病(Clonorchiasis)又称为肝吸虫病,是由华支睾吸虫(Clonorchis sinensis)寄生于人和哺乳动物肝胆管内引起的一种严重的食源性人兽共患寄生虫病。当人们因生食或半生食含有活的华支睾吸虫囊蚴的鱼虾后,即可感染,并在人体内发育为成虫并排卵。华支睾吸虫主要分布于东亚及东南亚地区,全球大概有三千多万人感染,其中仅中国感染人数就占了一半左右,是深受华支睾吸虫危害的国家之一。吉林省是我国华支睾吸虫感染的高发区域,其中扶余市是沿松花江流域的重灾区之一,对该地区进行华支睾吸虫病的流行病学调查势在必行。同时为明确物种基因型,对该地区的华支睾吸虫种株进行分子生物学分析,这对于了解物种的特异性有重大意义,同时建立分子生物学诊断方法,为临床诊断及防治提供了重要的分子生物学信息和方法。因此我们展开了对扶余市华支睾吸虫感染的分子流行病学研究。(1)扶余市沿江流域的流行病学调查我们对当地的三个镇子的14个村子,2142名村民进行了问卷调查,共收集到粪便样本1745份。利用改良加藤厚涂片对粪便样本进行初步筛查,共得到含有虫卵的阳性粪便样本513份。同时获得513份血清,最后通过实验室筛选后为实验室诊断试剂盒的研制提供阳性血清标本。对调查问卷中的相关数据(性别、年龄、生食鱼虾习惯、饮酒)进行了统计学分析,结果显示,男女感染比例分别是36.2%和21.3%,差异显著(P<0.01);患病率较高的年龄段集中在40-59岁;生食鱼虾习惯和饮酒习惯对于感染比率也存在显著差异(P<0.01,OR分别是3.211,1.97)。为进一步了解华支睾吸虫感染后可造成肝胆管的增粗、管壁增厚等影像学变化,我们对之前的513个阳性人群进行了肝胆胰脾的超声检查,结果显示其中18%的人的超声检查表现为肝内小胆管弥漫性的扩张和肝内胆管壁的增厚,2.5%表现为胆囊内不连续的梭形浮动的回声或胆囊结石表现。同时,我们对当地环境及三个镇子市售的10种淡水鱼和虾进行了囊蚴检测,发现其中麦穗鱼、白鱼、船丁鱼的囊蚴感染率较高。通过流行病学的调查得到的结论是:1)改良加藤厚涂片法仍是规模性华支睾吸虫病现场检测的快速手段;2)生食鱼虾的习惯是感染华支睾吸虫的重要途径,同时男性、高年龄及饮酒习惯都影响感染率的危险因素;3)超声检查可作为华支睾吸虫病诊断的便捷的辅助检查方法;4)改善卫生环境及不良的饮食习惯是控制该病的根本措施。(2)华支睾吸虫的特异性引物设计及筛选在对当地的市售鱼进行囊蚴检测的过程中,我们在鱼体内发现了形态似华支睾吸虫囊蚴和东方次睾吸虫的囊蚴。为从分子水平明确物种,也为后续的虫卵物种鉴定奠定基础,我们利用Gen Bank中的序列,通过对比,寻找特异性的保守区,从而设计出几对引物并进行筛选。利用普通PCR和多重PCR对引物进行筛选。结果寻找到Cs F2R3作为华支睾吸虫的特异性引物和Mo F2R2作为东方次睾吸虫特异性引物,测序结果显示两对引物扩增的序列分别与所鉴定物种具有高度同源性。(3)华支睾吸虫病的分子生物学诊断方法的建立和优化利用已经筛选出来的华支睾吸虫的特异性引物,建立PCR反应体系,并对反应条件进行优化,包括引物、模板浓度及反应时间等,从而获得最佳反应体系及反应条件,目的是为增加诊断的灵敏度,从而为后续的粪便虫卵DNA的基因扩增提供技术支持。通过反复的探索,最终我们成功建立了以华支睾吸虫DNA为模板的基因诊断方法。(4)扶余市松花江流域华支睾吸虫的虫种鉴定及核酸序列分析为了解扶余市松花江流域华支睾吸虫的基因型,利用已经筛选到的华支睾吸虫和东方次睾吸虫特异性引物对粪便中的虫卵DNA进行多重PCR,从而鉴定虫种及获得基因序列。结果显示513个虫卵阳性的粪便样本中均未发现东方次睾吸虫的感染,其中的265(51.7%)个样本显示为华支睾吸虫虫卵。通过BLAST对所获得的序列进行比对,结果显示与华支睾吸虫ITS2注册序列中的AF217099和AF217094同源性可达到99-100%。结论:PCR的方法是诊断华支睾吸虫病非常有效的确诊手段,虽操作相对繁琐,却增加了华支睾吸虫病诊断的精确性,减少了误诊率,可作为确诊手段;通过PCR的方法我们筛选出了标准的华支睾吸虫病患者的阳性血清,为诊断性试剂盒的研制提供了重要的标本支持。