研究内容:本研究共分为四部分:1.黄曲霉毒素B1对人肝细胞株HL-7702生物学行为的影响研究;2.黄曲霉毒素B1对人肝细胞株HL-7702影响的全转录测序研究及差异表达分析;3.黄曲霉毒素B1对人肝细胞株HL-7702影响的全转录组关联分析;4.黄曲霉毒素B1对人肝细胞株HL-7702的影响与TP53突变的原发性肝细胞癌的转录组联合分析及验证目的:研究黄曲霉毒素B1（AFB1）在肝微粒体代谢后的次级代谢产物对肝细胞株HL-7702的影响材料和方法:AFB1+NADPH（2mM最终浓度）+肝微粒体（1.5mg/mL最终浓度）与PBS混合,放入37℃、5%CO2恒温培养箱中孵育30分钟,获得AFB1在肝微粒体代谢后的次级代谢产物混合液。将上述混合液干预人肝细胞株HL-7702,培养箱中孵育30分钟,PBS清洗三遍后加入含10%胎牛血清的DMEM完全培养液继续培养。用MTT法检测24小时至96小时不同浓度AFB1对细胞株HL-7702的生长活性的影响。用流式细胞仪检测AFB1干预后24小时的HL-7702细胞株周期和凋亡情况。酶联免疫法检测AFB1干预后24小时的HL-7702细胞株8羟基脱氧鸟苷（8-OHdG）变化。Sanger法对AFB1干预后96小时的HL-7702细胞株进行TP53 R249S突变检测。数据统计和计算采用SPSS 22.0软件包,作图使用GraphPad Prism 6.0软件。符合正态分布的计量资料的描述使用均数±标准差进行描述。用t检验对正态分布的计量资料分组之间进行比较。P<0.05为统计学差异达到显著性。结果:1.MTT结果显示:HL-7702细胞在AFB1处理后24小时和48小时,实验组（AFB1浓度为:0.001μM,0.005μM.0.025μM,0.125μM,0.625μM,1.25μM 和 2.5μM）、阳性对照组及空白对照组之间细胞增殖活性无显著性差异,于AFB1处理后72小时至96小时,各组细胞增殖活性出现显著差异,不同浓度的AFB1处理的HL-7702细胞增殖活性均有不同程度降低,AFB1浓度越大,细胞增殖活性越低。细胞培养至96小时,正常细胞组、对照组和AFB1浓度为0.00lμM组间细胞增殖活性差异统计学无显著性（P>0.05）,其余各组之间细胞增殖活性差异有显著性（P<0.05）。2.流式细胞技术检测浓度为2μM和0.2μM AFB1干预的HL-7702细胞G1-G0期或G2-M期比例与浓度为0.02μM组比较均有显著差异（P<0.05）。而浓度为0.02μM干预组与肝微粒体对照组和空白对照组比较,无显著差异。3.浓度为2μM和0.2μM AFB1干预的HL-7702细胞8-OHdG含量较浓度为0.02μM干预组均显著增加（P<0.001）,0.02μM干预组与肝微粒体对照组和空白对照组无显著差异。4.浓度为2μM的AFB1在肝微粒体代谢后产物干预HL-7702细胞能诱发细TP53 R249S第三位碱基G突变成T。结论:AFB1在肝微粒体代谢后的产物抑制人正常肝细胞株HL-7702生长活性并导致G2/M细胞周期停滞,并呈浓度相关性;但AFB1在2μM及以下浓度短期干预未引起HL-7702细胞早期凋亡。AFB1在肝微粒体代谢后产物干预HL-7702细胞能诱发细TP53 R249S第三位碱基G突变成T目的:用全转录组测序技术检测AFB1对肝细胞株HL-7702影响的全转录组变化情况,并进行显著差异表达的转录组进行分析。材料和方法:实验组用AFB1（0.2μM）+NADPH（2mM最终浓度）+肝微粒体（1.5mg/mL最终浓度）,对照组用肝微粒体+NADPH,放入恒温培养箱中孵育30分钟,孵育后混合液干预HL-7702细胞30分钟,PBS清洗三遍,然后加入完全培养液继续培养48小时。胰酶消化,收集细胞,标注标签,液氮速冻,干冰运输至检测公司进行全转录组测序和测序数据分析。结果:通过全转录组测序,发现AFB1影响肝细胞株HL-7702以下转录组显著差异表达:1.1027基因mRNA显著差异表达,其中上调432个,下调595个,GO富集分析显示,AFB1引起mRNA显著差异表达的基因主要参与了调控细胞周期、增殖、凋亡、粘附、代谢、细胞化学刺激反应、DNA损伤修复和血管生成等生物学进程。KEGG通路分析提示AFB1可能影响TNF信号通路、TGF-β、染色体重组、P53信号通路、NF-κB信号通路、细胞周期、粘附和AMPK信号通路等。2.显著差异表达lncRNA共29个,其中上调15个,下调14个。3.显著差异表达的共miRNA9个,其中上调3个,下调6个4.显著差异表达的circRNA共72个,其中上调35个,下调37个结论:AFB1显著影响肝细胞株HL-7702的mRNA、lncRNA、miRNA和circRNA的表达,对其显著差异表达的基因进行富集分析显示:差异基因参与了细胞周期、增殖、凋亡、粘附和DNA损伤修复等生物学进程。并可能参与调控TNF信号通路、TGF-β、染色体重组、P53信号通路、NF-κB信号通路、细胞周期、粘附和AMPK等信号通路。目的:在转录组水平探索AFB1对肝细胞株HL-7702影响的各转录组变化之间的关联性及其可能的相互调控机制。材料和方法:分析材料来源于论文第二部分全转录组测序数据。使用Novofinder（诺禾致源）、miRanda-3.3a、PITA、RNAhybrid、psRobot、GOSeq-topGO:Release 2.12、KOBAS:version 2.0、Cytoscape 等软件对显著差异表达的全转录组数据进行关联分析,并构建ceRNA调控网络。结果:1.AFB1影响细胞株HL-7702显著差异表达的29个lncRNA和mRNA显著差异表达的757个基因之间有共存或共表达的关系。其中lncRNAs上调,伴随mRNA上调的靶基因有234个;lncRNAs下调,伴随mRNA下调的靶基因有439个。功能富集分析提示这些差异基因和细胞周期的调节、分化、细胞代谢、DNA重组及损伤修复有关,并和P53信号通路、癌症相关信号通路相关。2.AFB可能影响HL-7702细胞以下lncRNA与miRNA之间的调控:CDKN2B-AS1 与 hsa-miR-122-5p 和 hsa-miR-455-3p,CTD-3014M21.1 与hsa-miR-41 1-5p 和 hsa-miR-3591-3p,LINC00162 与 hsa-miR-3591-3p 和hsa-miR-494-3p,PP7080 与 hsa-miR-122-5p 和 hsa-miR-3690,PSMA3-AS1与 hsa-miR-455-3p 和 hsa-miR-41 1-5p,RP11-658F2.8 和 hsa-miR-31-5p,SBF2-AS1 与 hsa-miR-41 1-5p,SCARNA9 与 hsa-miR-379-5p。3.本研究发现9个显著差异表达的miRNA（hsa-miR-455-3p、hsa-miR-41 1-5p、hsa-miR-31-5p、hsa-miR-381-3p、hsa-miR-379-5p、hsa-miR-494-3p、hsa-miR-122-5p、hsa-miR-3690、hsa-miR-3591-3p）共调控534个mRNA显著差异表达的靶基因。基因富集分析提示这些候选靶基因参与调控细胞分子功能、细胞代谢与发展进程以及蛋白结合的调控,并参与调控细胞周期、PI3K-Akt信号通路、P53信号通路、AMPK信号通路、NF-kB信号通路等。4.AFB1可能影响HL-7702细胞以下circRNA与基因之间的调控:hsa_circ₀078538-EZR、hsa_circ₀017348-ZNF124、novel_circ₀005089-ZNF124、novel_circ₀002289-CEP 128、novel_circ₀000551-BIRC2)5.对全转录组差异表达数据进行ceRNA网络分析,共构建出以6个miRNA（上调:hsa-miR-455-3p、hsa-miR-411-5p、hsa-miR-31-5p;下调:hsa-miR-122-5p、hsa-miR-3690、hsa-miR-3591-3p）为核心的lncRNA-miRNA-gene 调控网络。结论:全转录组关联分析提示AFB1影响HL-7702细胞的lncRNA,miRNA,circRNA和mRNA之间存在相互调节关系。用显着差异表达的miRNA（hsa-miR-455-3p,hsa-miR-41 1-5p,hsa-miR-3 1-5p;hsa-miR-122-5p,hsa-miR-3690,hsa-miR-3591-3p）构建出六个 lncRNA-miRNA-基因调控网络。目的:利用论文第二部分全转录组差异表达数据和TCGA数据库TP53 R249S突变与不突变的HCC显著差异的表达谱进行联合分析,挖掘AFB1与TP53 R249S突变HCC具有共同作用的分子标志物。研究它们在HCC中TP53 R249S突变的作用,探索AFB1在其相关性HCC的发生及疾病进展的机制。材料和方法:从TCGA数据库获取HCC的表达谱（mRNA、lncRNA和miRNA）、临床病理及预后资料,以TP53 R249S突变与否进行分组,获取显著差异的表达谱信息,然后与论文第二部分差异表达的全转录测序数据进行联合分析,取交集获得候选差异表达谱信息。并在本中心已完成TP53 R249S突变测序的HCC样本进行验证,分析其与临床病理及预后之间的关系。利用GO和KEGG进行分子生物学功能及相关通路机制预测。TCGA原发性肝癌表达谱数据表达差异分析采用EdgeR软件包处理。候选表达谱差异基因癌和癌旁组织统计学差异分析采用配对样本t检验,其次,基因在TP53 R249S突变和非突变肿瘤和癌旁组织样本的相对表达量统计学差异分析采用独立样本t检验。比较突变组与非突变组、候选表达谱基因高表达和低表达组两组间各项临床因素的分布差异用卡方检验。各临床因素与临床预后的分析采用Kaplan-Meier生存曲线、单因素Cox风险模型。各组间曲线统计学差异比较采用Log Rank检验。各个分组风险比（Hazard Ratio,HR）与 95%置信区间（Confidence Interval,CI）评估 TP53 R249S突变状态以及基因表达量高低与临床预后的相关性。统计学分析均采用SPSS 22.0,P<0.05被认为差异达到统计学显著性。统计作图采用GraphPad Prism 6.0软件绘制。结果:1.AFB1干预后HL-7702细胞株的全转录组测序数据与TCGA数据库中HCC TP53 R249S突变的表达谱共同分析筛选出6个mRNA显著差异表达的基因,包括上调基因:CTXN1、CDCP1、CALB2;下调基因:CRYAB、EN03、GPRC5A。未发现有共同显著差异表达的lncRNA或miRNA。2.独立样本验证中发现 CDCP1、CALB2、CRYAB、EN03 和 GPRC5A 5个基因在癌组织中mRNA表达水平低于癌旁组织（P<0.05）,在TP53 R249S突变的癌组织中CALB2、CRYAB和GPRC5A的mRNA表达水平要高于TP53非突变的癌组织（P<0.05）。3.CDCP1和CTXN1可能与HBV DNA复制有显著相关（两者P=0.035）而CTXN1和GPRC5A可能与HCC的分化程度显著相关（两者P=0.047）。4.TP53 R249S突变与TCGA数据库HCC的TNM分期有关（P=0.039）,分期越晚,突变可能性越大。TP53 R249S非突变的患者总生存时间（t=1791 days）长于存在突变患者（t=334 days）。对重要的复发生存时间而言,HCC患者携带非突变的TP53 R249S复发风险更低（HR=0.37,95%CI=0.19-0.73,P=0.003）5.生物信息学功能富集分析提示CALB2、CRYAB和GPRC5A可能与TP53基因存在调控关系。结论:全转录组测序数据与TCGA数据库中HCC TP53 R249S突变的表达谱共同分析筛选出6个mRNA显著差异表达的基因,包括CTXN1、CDCP1、CALB2、CRYAB、EN03、GPRC5A。其中CALB2、CRYAB 和GPRC5A可能参与TP53基因调控以及与TP53 R249S突变相关。TP53 R249S突变与HCC患者不良预后有关。