【摘 要】
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第一部分经BMP9诱导后C3H10T1/2细胞中β-catenin表达情况目的:通过高滴度重组腺病毒Ad-GFP和Ad-BMP9转染C3H10T1/2细胞,检测细胞中β-catenin表达情况。方法:取冻存HEK293细
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第一部分经BMP9诱导后C3H10T1/2细胞中β-catenin表达情况目的:通过高滴度重组腺病毒Ad-GFP和Ad-BMP9转染C3H10T1/2细胞,检测细胞中β-catenin表达情况。方法:取冻存HEK293细胞复苏并传代培养,用于扩增并提高重组腺病毒Ad-GFP和Ad-BMP9滴度。用适量高滴度腺病毒转染C3H10T1/2细胞,干预24小时,通过倒置显微镜观察C3H10T1/2细胞状态,并在荧光倒置显微镜下观察细胞内绿色荧光蛋白GFP表达情况,利用流式细胞仪检测腺病毒的转染效率。于腺病毒干预3天后,q RT-PCR检测细胞β-catenin基因的表达,并在干预一周时通过Western blot和免疫荧光技术检测β-catenin的表达。结果:1、倒置显微镜观察各组C3H10T1/2细胞,较之于对照组,Ad-BMP9组细胞排列有序,生长规则、呈长梭形。2、荧光倒置显微镜下观察Ad-GFP和Ad-BMP9组细胞成功表达GFP,流式细胞术检测两组细胞腺病毒转染效率均在44%左右。3、q RT-PCR结果提示Ad-BMP9组β-catenin基因虽有增高趋势,但差异不具有统计学意义。4、Western blot显示β-catenin蛋白的表达明显提高。5、免疫荧光技术同样提示β-catenin蛋白表达增高。结论:通过HEK293细胞扩增所得的腺病毒可以成功转染C3H10T1/2细胞,并且转染效率较高;Ad-BMP9干预后C3H10T1/2细胞β-catenin表达量明显增高。第二部分特异性抑制剂阻断β-catenin后BMP9所诱导C3H10T1/2细胞成心肌样细胞分化的情况目的:利用特异性抑制剂XAV939阻断β-catenin后,观测BMP9所诱导C3H10T1/2细胞成心肌样细胞分化的情况。方法:通过Western blot法检测联用Ad-BMP9和β-catenin特异性抑制剂XAV-939后β-catenin的激活情况;在Ad-BMP9干预1周时,q RT-PCR检测心肌细胞特异性标志物MEF2C、GATA4 m RNA水平,Western blot检测Ad-BMP9诱导3周时心肌特异性蛋白CX43和c Tn T的表达,并用免疫荧光技术检测CX43的表达。结果:1、随着XAV939剂量的增加,Ad-BMP9组β-catenin蛋白的表达逐渐降低,当XAV939浓度到达15μmol/L时,XAV-939可以完全抑制β-catenin的表达。2、β-catenin能被BMP9激活并参与BMP9所诱导的C3H10T1/2细胞成心肌细胞样细胞分化。结论:β-catenin能被BMP9激活并参与BMP9诱导的C3H10T1/2细胞成心肌细胞样细胞分化。
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