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研究背景与目的:肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）是最主要的原发性肝癌类型,并且是致死率较高的肿瘤之一,其高致死率的原因源于该类肿瘤在临床上具有较高的耐药率、复发率和转移率。当前很多研究认为这些临床现象主要是由于肝癌干细胞（Liver cancer stem cells,LCSCs）的存在所引起。目前已有研究团队尝试开发数种靶向CSCs的药物,这些药物的靶向策略包括靶向CSCs生物标志物、阻断CSCs的信号通路、破坏CSCs存活的微环境以及阻断耐药机制的药物。但由于CSCs复杂的调控机制和肿瘤具有较高的异质性和可塑性,目前想利用单一药物来彻底消除肿瘤中的CSCs仍存在较大困难。因此利用多种药物联合靶向CSCs是最大程度杀灭CSCs的可靠方法。然而目前对于肝癌如何诱发与支持LCSCs的调控机制尚不完全清楚,因此限制了当前临床靶向药物的开发。所以本课题研究的目标即在于透过分子与细胞生物学的方法尝试挖掘新的LCSCs生物标志物或调控机制,以期研究成果对于未来开发临床药物消除LCSCs的策略能有所贡献。研究方法:通过成球实验培养富含CSCs的球状细胞,然后利用转录组测序（RNA sequencing,RNA-Seq）鉴定球状细胞和普通培养的贴壁细胞之间的差异表达基因。接着再利用实时荧光定量PCR（Quantitative real-time PCR,q RT-PCR）验证RNA-Seq测序结果的准确性和可靠性。之后由球状细胞中,有显著上调的基因里挑选未被报道过与CSCs有关联的基因来做进一步研究。经由此筛选过程确定欲研究的目标基因后,首先,我们以蛋白质免疫印迹实验（Western Blot,WB）检测目标基因在多种肝癌细胞系中的蛋白表达,进而挑选目标基因相对表达高的肝癌细胞系通过短发夹RNA（short hairpin RNA,sh RNA）技术来稳定敲低目标基因的表达,同时在目标基因相对低表达的肝癌细胞系中,构建稳定高表达外源性目标基因的细胞系。之后通过经典的检测CSCs特性的成球实验和流式细胞分析术来验证目标基因在肝癌细胞系中的改变是否会影响成球效率（Sphere-forming efficiency,SFE）和LCSCs表面标志物CD133和CD90的表达。并利用q RT-PCR和WB验证目标基因与CSCs相关通路和促干性转录因子之间的关系。最后,利用异体移植成瘤模型在小鼠体内检测目标基因表达对癌细胞生长与成瘤率的影响。结果:1.RNA-Seq结果显示,在球状细胞与贴壁细胞之间有1860个具有统计学意义的差异表达基因（P＜0.05）,其中1104个上调基因和756个下调基因。2.利用q RT-PCR实验验证前15个在球状细胞中上调的基因,只有10个与RNA-Seq数据一致,其中丙氨酸-乙醛酸氨基转移酶（Alanine-glyoxylate aminotransferase,AGXT）未曾被报道过参与CSCs相关调控。基因集富集分析（Gene set enrichment analysis,GSEA）显示AGXT高表达可富集到CSCs相关通路。3.WB实验显示AGXT在肝癌细胞系Huh7和Hep3B细胞中高表达,在MHCC-97H和PLC/PRF/5细胞中低表达。利用sh RNA构建AGXT稳定敲低的Huh7和Hep3B细胞株,同时在MHCC-97H和PLC/PRF/5细胞中构建AGXT稳定过表达的细胞株。利用WB实验证明细胞株构建成功。利用成球实验和流式分析术检测稳定细胞株的干性特性。成球实验显示改变AGXT表达不能影响SFE;流式细胞分析术实验显示改变AGXT表达不影响CD133+/CD90+细胞族群的比例。4.软琼脂克隆形成实验显示,AGXT表达升高不影响癌细胞克隆形成能力;划痕实验、Transwell迁移实验、细胞集体迁移实验表明,AGXT表达升高不促进癌细胞的迁移能力;阿霉素和顺铂药物耐药实验表明,AGXT表达升高不影响癌细胞的耐药性。5.利用流式细胞分选技术将CD133+的LCSCs分选出来,并将CD133+LCSCs中的AGXT基因敲低,可明显降低CD133+细胞的SFE（P＜0.001）,但在CD133-的肝癌细胞中敲低AGXT并不会影响其SFE。同时,在球状细胞中敲低AGXT也能降低球状细胞的SFE（P＜0.001）。流式细胞分析术实验显示,在CD133+LCSCs细胞和球状细胞中敲低AGXT均能降低CD133+细胞群体比例。6.q RT-PCR和WB实验结果显示,过表达AGXT可以升高肝癌细胞中干性转录因子SOX2（P＜0.001）和OCT4（P＜0.01）的表达水平;敲低AGXT可以降低SOX2（P＜0.001）和OCT4（P＜0.001）的表达水平。在CD133+细胞中将AGXT敲低后,重新过表达SOX2和OCT4,AGXT敲低所引起的SFE下降可以重新上升（P＜0.001）。7.小鼠异体移植肿瘤模型实验显示,在野生型Huh7细胞中敲低AGXT不会影响癌细胞的成瘤率;但在球状Huh7细胞中敲低AGXT可以明显降低癌细胞在小鼠上的成瘤率（P＜0.001）。结论:1.AGXT在富含LCSCs的球状细胞中高表达。2.AGXT表达升高不能驱动HCC细胞的干性增加,也不影响HCC细胞克隆形成能力、迁移能力和耐药性。3.AGXT通过上调干性转录因子SOX2和OCT4的表达来维持LCSCs的干性特征。