一、研究背景心血管疾病已经成为当今世界对人类健康危害最严重的一类疾病,而随着人们物质生活水平的不断提高、人口老龄化的不断发展,心血管疾病的患病率仍会呈现持续增加趋势。作为心血管疾病的典型代表,急性心肌梗塞或心肌梗死(myocardial infarction, MI)具有较高的死亡率和发病率,是全球范围内重大的健康问题之一。依据世界卫生组织(World Health Organization,WHO)的数据,心肌梗死占到目前全球死亡的30%,同时预计到2030年每年至少有2300万人死于该病发作,且其发病率呈逐年上升趋势。其中心肌细胞受损和缺血是心肌梗死中最常见的病理改变,而成年心肌细胞作为一种高度分化的终末细胞,一般认为其不能再生。目前,对于急性心肌梗死的病人,我们通常会及时的应用药物治疗以及PCI等手段进行治疗,旨在及早高效的恢复心梗后缺血心肌血液供应,阻止心肌缺血性损伤的进一步发展、加重,减少心肌梗死面积,从而最终改善心肌梗死临床预后。尽管当前我们对于心肌梗死的治疗取得了长足的进步,但仍无法从根本上逆转心室重构以及后续的心功能不全与心力衰竭,这也就意味着我们的治疗手段仅能控制、减小心肌梗死所带来的不良预后,而不能从根本上达到“救治”已经受损的心肌细胞甚至“治愈”的效果。当前,利用干细胞治疗心肌梗死的研究已成为心血管疾病的一个重要研究领域,并得到广泛的关注和研究,已有多种干细胞在实验室或临床应用于心肌梗死的干细胞治疗中,主要包括骨髓源间充质干细胞、脂肪源间充质干细胞、诱导多能性干细胞及胚胎干细胞等,虽然取得了一定的治疗效果,但这种效果是不稳定且不显著的,同时诱导多功能干细胞和胚胎干细胞治疗还面临着致瘤性和伦理学问题。心肌球源性干细胞(cardiosphere-derived cells ,CDC)是由心脏组织块培养而来,表达c-kit及Islet-1心肌组细胞以及众多周围支持细胞共同组成的心脏源性细胞亚群,可稳定传代的干细胞。一项最新的CADUCEUS临床研究表明,经冠脉移植自源性心肌球源性干细胞治疗的患者在一年后,相较于一般患者瘢痕组织减少,有效心肌数量增加,心功能得到改善,且并没有其他安全风险,因此,心肌球源性干细胞是当前最有前景的移植治疗心肌梗死的干细胞类型之一。尽管心肌球源性干细胞移植治疗在动物和患者身上都能保护并改善心梗后的受损心肌,当它和其他干细胞治疗方案一样仍面临着移植后宿主心脏恶劣微环境所导致的低存活率的瓶颈,这些恶劣的微环境包括较高的炎症因子和大量的氧自由基。当前已有多项在动物身上的研究应用遗传基因改良的操作,向干细胞中引入改善移植后存活的相关基因以期解决这一难题,例如PHD2、AKT、Bcl-2,SDF-1以及趋化因子受体1等。虽然这些研究取得了一定成果,但离实际的临床应用还有一定的距离。当然,如果能找到一种临床上已知且能够有效地提高干细胞移植后的存活率的药物,,从而提高干细胞治疗的效果,将十分鼓舞人心。在近年多项研究中发现,二甲双胍(metformin,MET),作为治疗2型糖尿病的一线临床药物,可激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)。AMPK是一种蛋白激酶,它能够促进脂肪酸氧化,促进葡萄糖运输,加速糖酵解,抑制体内甘油三酯和蛋白质合成,与此同时,体外实验表明激活AMPK可通过保护线粒体凋亡的机制促进心肌细胞的存活。令人惊喜的是,一项在狗身上进行的研究证实了二甲双胍能够通过AMPK依赖的途径减少氧化应激所导致的心肌细胞凋亡,从而表明二甲双胍具有潜在的独立于降糖作用之外的心脏保护作用,进而具有减轻缺血再灌注引起的损伤的效果。AMPK是调节细胞能量代谢稳态的关键因子,对于干细胞的存活亦有重要作用。在一项关于胚胎干细胞的研究中,eNOS的过表达帮助干细胞维持低含量的NO,从而减少胚胎干细胞的凋亡。心肌球源性干细胞是有离体心脏组织在体外分离、培养获得的,与心脏细胞有同源性,同时,eNOS是一种潜在的独立细胞保护信号分子,在血管内皮细胞、心肌细胞以及不同类型的干细胞中有所表达,CDCs中eNOS也有表达。考虑到心肌球源性干细胞和心肌组织的同源性,我们提出如下科学问题:二甲双胍能否拮抗超氧应激对CDCs的损伤作用、提高其存活率,进而增强CDC移植治疗心肌梗死的效果?这种保护作用是通过激活AMPK/eNOS信号通路来介导的吗?二甲双胍这种抗氧化应激功能对于心肌球源性干细胞是否有类似的保护作用,二甲双胍能否实质性的提高心肌球源性干细胞移植后的在体存活率,以及二甲双胍的引入能否有效提高心肌球源性干细胞移植治疗心肌梗死的治疗效果,本研究期待探讨这些问题的答案。二、研究内容和方法1、分离提取心肌球源性干细胞:将已有的GFP转基因标记的C57小鼠的心脏组织迅速剪取离体,切成体积小于小鼠的心脏组织被切成体积小于1mm3的碎片,经胰岛素部分酶解后,将这些组织碎片移植在含有2毫升CEM,被纤连蛋白覆盖的培养皿中进行培育。经历足够的增长周期(约1周)之后,用温和的酶消化、收获包裹心脏组织块周围松散的、呈阶段性扩散增殖的贴壁类基质细胞,以1×105 cells/ml的密度被接种在由多聚赖氨酸覆盖的含CGM培养皿中。收集培育而来的自由悬浮的心肌球(cardiospheres),转入普通培养瓶中继续培养,得到心肌球源性干细胞。建立体外心肌球源性干细胞氧化应激损伤模型:将生长状态良好的心肌球源性干细胞在不含血清的介质中培育24小时,之后在含有30 μmol/L双氧水的培养基中继续培育24小时以诱导细胞死亡。建立小鼠心梗模型:选用4个月左右年龄的成年雄性C57小鼠构建小鼠MI模型进行研究。在异氟烷吸入麻醉的状况下,对小鼠进行左前降支(LAD)冠状动脉的永久结扎,LAD动脉在直视下用7-0丝绸缝合线进行永久结扎。对于对照组小鼠,除了永久结扎LAD部分,对其实施了相同的外科手术方法。建立大鼠心肌缺血-再灌注损伤模型:对大鼠进行左前降支(LAD)冠状动脉的临时结扎,30分钟后解除结扎并诱导再灌注。2、为了明确在体外氧化应激损伤模型中二甲双胍能否提高心肌源性干细胞的存活率,我们在构建氧化应激损伤模型前,对心肌球源性干细胞用MET以不同的剂量(1、10、100、1000、3000、5000μmol/L),以不同的处理时长(15、30、60、120、180分钟)进行预处理,以期减少H202诱导的心肌球源性干细胞细胞凋亡。3、为了明确及量化移植后在体心肌球源性干细胞的存活率,在GFP-CDC移植手术之后,在适当的时间点以酶消化的方法将取出的小鼠心脏酶解,分离成单个的心脏来源的细胞。其中GFP阳性的细胞即代表了心肌球源性干细胞和它们的派生细胞,我们对其进行仔细计数,最后我们得到移植后在体心肌球源性干细胞的存活率:100%×(存活的GFP阳性细胞数量/ 1×105)。为了观察心脏在体的GFP阳性心肌球源性干细胞的存活率,用GFP抗体、a-actinin抗体和DAPI对心脏组织进行染色观察。4、为了明确二甲双胍对心肌球源性干细胞的保护作用能否应用于改良此种干细胞对心肌梗死的治疗,小鼠心梗模型的基础上,术后在梗死边缘区四点分别进行一次心肌内注射,根据注射内容的不同分为PBS+MI组、MET+MI组、CDC+MI组和MET+CDC+MI组。在小鼠接受手术后的第2、4周,以双盲法的形式用超声波心动描记术来评估清醒小鼠的心肌结构和功能,包括左心室射血分数EF、左心室短轴缩短率FS及左心室舒张内径LVIDd。同时通过masson染色的组织学方法对小鼠心肌梗死面积和心肌各部位纤维化程度进行形态定量分析。5、进一步明确二甲双胍对心肌球源性干细胞的保护作用并探讨其相关机制。对心肌球源性干细胞进行不同的处理,加入适宜剂量的MET,加入AICAR以激活AMPK,加入Compound-C以阻止AMPK。对接受不同方法处理后的CDC细胞,用CCK8检测处理后各组细胞活性;进行AnnexinV及PI共染色,然后经流式细胞仪分析,观察经不同处理后心肌球源性干细胞中凋亡细胞的比率;通过Tunel染色检测接受不同方法处理后的心肌球源性干细胞中凋亡细胞的比率。6、为了进一步探讨二甲双胍保护心肌球源性干细胞的具体机制,我们还通过免疫印迹的方法对AMPK (二甲双胍发挥抗氧化应激功能的关键因子)及其磷酸化水平、eNOS及其磷酸化水平进行了检测。三、研究结果1、在心肌梗死的动物模型和体外氧化应激损伤模型都发现,MET可有效保护心肌球源性干细胞的存活。体外实验证明,二甲双胍对心肌球源性干细胞的这种保护作用呈时间、浓度依赖型关系,我们通过系列实验最终确定了 MET保护心肌球源性干细胞的最适作用时间及浓度(60min,1000μmol/L)。2、动物实验证实,单纯的心肌球源性干细胞移植可提高小鼠心肌梗死后心功能、减小梗死面积及纤维化程度,但改善程度有限。经过二甲双胍的预处理,联合心肌球源性干细胞移植和二甲双胍治疗的方案可进一步改善小鼠心肌梗死的预后。3、二甲双胍主要通过发挥其抗氧化应激作用来提高心肌球源性干细胞存活率,这种保护作用依赖于AMPK介导的分子途径。在细胞实验中,引入AMPK激动剂AICAR和AMPK抑制剂Compound C替代实验组中的MET,从阳性对照和阴性对照两方面进一步观察AMPK信号途径对心肌球源性干细胞存活率及凋亡情况的影响。结果发现MET和AICAR都可以提高氧化应激条件下心肌球源性干细胞的存活率,使心肌球源性干细胞TUNEL阳性细胞减少,使AnnexinV染色阳性比率细胞减少,而Compound C则可以抵消这些改善作用。结果表明MET是通过激活AMPK对心肌球源性干细胞发挥抗氧化应激作用的。4、AMPK是一种蛋白激酶,其下游还有很多效应分子。作为潜在的细胞保护信号分子,eNOS在血管内皮细胞、心肌细胞以及不同种类的干细胞中都有表达。在心肌球源性干细胞的细胞试验中我们发现,MET可增加AMPK Thr-172位点及eNOS Ser-1177位点的磷酸化水平,AICAR具有类似的相应,相对于的,这些效应都可被Compound C 所阻断。四、结论二甲双胍可提高心肌球源性干细胞移植后的存活率,从而进一步提高移植心肌球源性干细胞对心肌梗死的治疗效果,并有效地促进梗死心肌的保护与修复。这种保护作用是通过激活AMPK-eNOS通路发挥的。