病毒性心肌炎（VMC）是由嗜心肌病毒感染心脏组织引起的以炎性细胞浸润为主要病变的心脏炎症疾病。心肌炎可由细菌、病毒、非感染因素等多种原因引起，但在发达国家中病毒感染是导致心肌炎的主要原因。心肌炎好发于无病史的健康青少年，9.6％以上的不明原因心衰是由心肌炎引起的，并且在青少年猝死疾病中，8.6%-42%的案例也是由心肌炎引起的，由于难以诊断和收集活体样品，其真实发病率可能更高。心肌炎的发病存在性别差异，男性比女性更易感染心肌炎。病毒性心肌炎病程可分为三个阶段，首先是病毒大量复制导致心肌细胞结构损伤和裂解，然后免疫细胞响应危险信号，在心脏浸润产生炎症以试图控制疾病发展，最后若病毒在心肌组织中未被彻底清除或产生自身抗原，炎症长期无法复原，则会进一步发展为扩张性心肌病（DCM），使心脏功能不断衰竭。目前对病毒性心肌炎尚无明确的诊断和治疗方法，因此研究病毒性心肌炎的发病机理具有十分重要的意义。可以引起病毒性心肌炎的病毒类型包括肠道病毒、腺病毒、流感病毒、细小病毒、疱疹病毒等，B3型柯萨奇病毒（CVB3）是其中主要的病原体之一，CVB3属于肠道病毒，是小RNA病毒科的无包膜单股正链RNA病毒，主要经粪-口途径传播。CVB3通过肠道进入机体后可以引起严重的心脏、胰腺、脾脏等器官感染，CVB3病毒颗粒通过细胞表面的柯萨奇病毒-腺病毒共同受体（CAR）和衰变加速因子（DAF）的介导而被细胞内吞，接着在细胞内复制完成感染的过程。小鼠感染CVB3病毒约7天后可以发展为急性心肌炎。虽然CVB3病毒感染心肌细胞后大量复制并直接裂解破坏细胞是病毒性心肌炎的产生原因，但细胞通过各类模式识别受体（PRR）识别内源性的损伤相关分子模式（DAMPs)和病毒的病原相关分子模式（PAMPs），诱发一系列关联的细胞因子分泌和炎性细胞浸润，形成炎症免疫应答才是病毒性心肌炎的主要发病原因。其中炎性细胞因子IL-17A在招募炎性细胞，诱导局部免疫反应中发挥着重要作用。IL-17家族包括IL-17A、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E、IL-17F六个成员，其需要与同源或异源二聚体受体结合再向下传递信号。IL-17受体（IL-17R）家族包括 IL-17RA、RB、RC、RD、RE五种成员。IL-17家族的主要成员通常发挥促炎效应。IL-17A与IL-17F以同源或异源形式结合，再与由IL-17RA/IL-17RC受体结合，启动下游炎症效应通路。IL-17A主要由Th17（T helper17）细胞分泌，CD8+T细胞、γδT细胞、NK细胞、Ⅲ型固有淋巴样细胞（ILC3）等也可分泌IL-17A。病毒性心肌炎中，Th17细胞的心脏浸润显著增高，从而使心脏局部IL-17A水平显著增高。IL-17RA广泛表达在许多不同类型的细胞表面，例如非造血细胞的上皮细胞、纤维细胞、软骨细胞以及造血细胞的巨噬细胞、中性粒细胞、T细胞等。IL-17A和IL-17RA结合后，通过活化胞内的NF-κB和MAPK等信号，促进受体细胞分泌各种细胞因子和趋化因子，包括粒细胞集落刺激因子（G-CSF）和CXC趋化因子家族、CCL趋化因子家族的一些成员等。其中G-CSF可以促进中性粒细胞增殖并从骨髓释放，而CXC趋化因子家族成员如 CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL8等的主要功能即趋化中性粒细胞迁移至炎症部位。IL-17A通过促进下游效应分子的分泌或者与其他效应分子合作，在各种疾病模型中构成了复杂的细胞因子和趋化因子分泌网络，促进各类炎性细胞的局部浸润和炎症效应。IL-17A/IL-17RA信号通路诱导的CXC趋化因子的上调表达，具有显著趋化中性粒细胞到达感染部位的作用。中性粒细胞在人外周血中占白细胞总数的50%-70%，是外周血中占绝对优势数量的免疫细胞。发生急性感染时，外周血中性粒细胞可在数小时内，迅速跨越组织迁移至感染部位，发挥重要的抗菌和促炎作用。中性粒细胞具有十分强大的功能，它既可吞噬病原体，又可主动释放胞外诱捕网（NET），捕获和限制胞外病原体，其胞内还具有丰富的内含物如髓过氧化物酶、弹性蛋白酶、防御素、抗菌肽等等，它还可以呼吸爆发方式产生大量活性氧（ROS），从而对抵御病原体起广泛的作用。多种细菌、真菌和寄生虫感染引起的疾病模型中，中性粒细胞正如一把双刃剑，发挥了重要的清除病原体和炎症等作用，对于疾病的发生发展发挥重要调节功能。然而其在病毒引起的疾病中的作用目前所知甚少。本研究分为三个部分：　　第一部分：CVB3-VMC发病过程中IL-17A和IL-17RA的组织细胞表达特性与性别差异表达。⑴CVB3诱导小鼠病毒性心肌炎模型的建立。小鼠感染CVB3可发展与人VMC相似的症状，以103TCID50剂量CVB3感染易感BALB/c雄鼠，或以104TCID50剂量感染不易感C57BL/6雄鼠，发现：自感染第三天小鼠体重开始下降，至第七天下降约20%，七天死亡率约30%；心脏石蜡切片HE染色可见发病小鼠心肌组织中浸润了大量的炎性细胞，与正常小鼠相比具有显著差异。表明建立了CVB3诱导BALB/c与C57BL/6小鼠的VMC模型。⑵小鼠VMC过程中IL-17A/IL-17RA信号通路相关分子表达水平的变化。为了探究IL-17A/IL-17RA炎症信号通路与病毒性心肌炎的相关性，我们检测了两种小鼠心脏组织中IL-17A和IL-17RA表达的变化。原代心肌细胞和心肌纤维细胞IL-17RA和IL-17RC的相对本底表达：发现：IL-17RA和 IL-17RC均主要在心肌成纤维细胞优势表达，其表达水平显著高于原代心肌细胞，CVB3感染后表达呈增高趋势。骨髓中性粒细胞非常显著的高表达IL-17RA，为心肌成纤维细胞的5倍左右。提示心肌成纤维细胞和中性粒细胞受IL-17A/IL-17RA通路的显著调控。雄性 BALB/c小鼠：CVB3感染后第7天，心脏 IL-17A水平显著上升（p<0.05），与对照相比上升约2-3倍。心脏IL-17RA水平显著上升2-3倍（p<0.05）。IL-17RA下游趋化因子 CXCL1和 CXCL2的表达水平显著高于对照组，特别是CXCL2水平上升10倍以上（p<0.001）。提示 CVB3感染 BALB/c小鼠后心脏IL-17A-IL-17RA-效应趋化因子通路显著性上调。雄性C57BL/6小鼠：心脏IL-17A蛋白水平显著高于对照组（p<0.001），IL-17RA水平显著高于对照组（p<0.001）；下游CXC趋化因子CXCL1、CXCL2水平也显著性高于对照组（p<0.001）。提示 IL-17A-IL-17RA信号通路密切参与C57BL/6小鼠VMC发病。⑶IL-17A和IL-17RA在雌雄小鼠的性别差异性表达。探究了不同性别小鼠的IL-17A、IL-17RA表达水平，发现BALB/c小鼠存在雄鼠VMC发病显著高于雌鼠的性别差异。检测感染第7天心脏IL-17A，IL-17RA及下游趋化因子的表达发现：IL-17A在雄鼠和雌鼠心脏均显著升高；但IL-17RA表达水平和IL-17RA下游趋化因子CXCL1和CXCL2的表达水平则是在雄鼠显著高于雌鼠（p<0.05）。提示 BALB/c小鼠 VMC发病的性别差异可能与IL-17A/IL-17RA信号通路的差异表达相关。　　第二部分：IL-17A敲除小鼠和 IL-17RA敲低小鼠均显著降低病毒性心肌炎并显著影响中性粒细胞心脏浸润。⑴IL-17A敲除对小鼠VMC发病及中性粒细胞浸润的影响。由于IL-17A在VMC发病中显著上升，因此探究阻断IL-17A对VMC发病的影响非常必要。以104TCID50剂量CVB3感染IL-17A敲除的C57BL/6小鼠，检测了病毒复制、心脏炎症浸润和中性粒细胞的浸润情况。CVB3感染第3天，IL-17A KO小鼠心脏病毒RNA复制和载量高于WT小鼠（p<0.05），提示IL-17A下游效应具有抗病毒作用。心脏HE染色病理显示：与WT小鼠相比，IL-17A KO小鼠的心脏炎症浸润显著降低。相一致的，心脏IL-17A水平在WT小鼠显著增高，而在IL-17KO小鼠显著降低，心脏IFN-γ也显示相同趋势。提示IL-17A具有促病毒性心肌炎作用。为了探究 IL-17A抗病毒复制、促进病毒性心肌炎是否与中粒细胞浸润相关，比较了IL-17A KO和WT小鼠心脏中中性粒细胞趋化因子及中性粒细胞浸润情况，发现：感染第3天IL-17A KO小鼠CXCL1和CXCL2有少许上升（P﹥0.05）。流式细胞术检测中性粒细胞发现：虽然IL-17A KO小鼠脾脏、外周血中性粒细胞比例和绝对数相比WT小鼠有上升，但是IL-17A KO后小鼠心脏浸润的CD45+CD11b+髓系细胞比例和绝对数显著降低（11%降至3.6%，p<0.05），这与心肌炎显著减轻相对应；其中心脏浸润 CD11b+Ly6G+中性粒细胞虽其比例由11.8%升至14.4，但其绝对数显著低于 WT小鼠（p<0.05），提示敲除 IL-17A可显著降低中性粒细胞的心脏浸润。⑵IL-17RA敲弱对小鼠VMC发病及中性粒细胞浸润的影响。IL-17RA作为重要的炎症调控受体，其与IL-17A结合后激活下游的效应对趋化因子表达及炎性细胞的招募起到了关键作用。为研究IL-17A/IL-17RA通路影响VMC发病的可能，通过in vivo JET-PEI技术以IL-17RA干扰质粒瞬转小鼠，体内下调小鼠IL-17RA表达水平，研究了IL-17RA敲弱对VMC的影响。IL-17RA-shRNA质粒的构建和筛选：为下调小鼠心脏IL-17RA的表达水平，设计了三个针对IL-17RA mRNA序列的shRNA，构建到pLL3.7质粒中，转染小鼠胚胎成纤维细胞系NIH-3T3，发现2号质粒干扰效率最高。依靠In vivo JET-PEI技术在小鼠体内瞬时转染60ug pLL3.7-IL-17RA-shRNA质粒，眼眶注射小鼠，检测第7天心脏IL-17RA表达情况，发现其表达相对空载质粒对照组显著下降，提示具有良好的体内敲弱效果。CVB3感染IL-17RA敲弱小鼠，发现第7天心脏病毒复制和载量与空质粒组相比均有降低趋势，提示IL-17RA通路具有促进病毒复制作用。病毒性心肌炎的发病情况，发现：IL-17RA表达敲弱后，小鼠心肌炎症细胞因子均有降低趋势，心肌炎与WT组相比略有减轻。流式检测检中性粒细胞水平，发现：IL-17RA敲低表达可减少心脏中性粒细胞趋化因子 CXCL1、CXCL2的表达，显著减少外周血中性粒细胞数目，提示IL-17RA通路可影响外周血中性粒数目而促进中性粒细胞的心脏浸润。　　第三部分：IL-17A/RA通路趋化的心脏浸润中性粒细胞在VMC发病中的作用及机制。⑴CVB3感染后脾脏和外周血中性粒细胞比例和绝对数均显著增高。CVB3感染后小鼠脾脏中性粒细胞的改变：以CD11b+Ly6G+标记中性粒细胞，流式检测了CVB3感染过程中脾脏中性粒细胞的改变，发现：感染第3天，脾脏浸润中性粒细胞比例由4.1%显著上升至5.3%，提示CVB3感染显著增加脾脏内中性粒细胞数目。CVB3感染后小鼠外周血中性粒细胞的改变：流式检测发现：感染第3天，外周血中性粒细胞比例由14.9%显著上升至22.2%，提示CVB3感染后显著促进了中性粒细胞在外周血的大量扩增。⑵单抗清除外周血中性粒细胞对VMC发病的影响。既然CVB3感染显著增加了外周血中性粒细胞的扩增，而中性粒细胞是IL-17A/IL-17RA炎症信号通路的重要效应细胞，则研究中性粒细胞在CVB3感染中的作用十分有意义。利用单克隆抗体anti-Ly6G（1A8）可特异清除中性粒细胞。尾静脉注射100ul Ly6G单抗一次，流式细胞术证实从1天后外周血中性粒细胞清除效率达到90%以上，清除效果可维持至约第9天。以100ul Ly6G单抗和100ul同型对照抗体尾静脉注射小鼠，1天后注射CVB3病毒，检测第7天病毒复制水平，发现：同型对照小鼠第7天病毒水平较低，而 Ly6G单抗注射小鼠心脏 CVB3水平显著上升。提示中性粒细胞可能具有清除CVB3病毒的作用。检测了中性粒细胞清除后的VMC发病：发现，与对照组比较，清除中性粒细胞后，小鼠生存率提高（87%-92%），血清 CK-MB水平降低，提示 CVB3诱导的心肌炎有所减轻。但第7天心脏HE染色的病理差别不甚显著，心脏炎症细胞因子IL-1β和TNF-α水平有少许升高。心脏IL-17RA、CXCL1/2水平上调，提示中性粒细胞清除可能具有促炎症的功能。需要进一步重复试验。⑶中性粒细胞抗CVB3病毒复制的机制初步探讨。中性粒细胞被报道具有吞噬、抗菌、诱导NET等作用机制，初步研究了体外中性粒细胞对于CVB3病毒的抑制作用和NET形成，但结果不理想，需进一步试验。研究提示：CVB3感染易感和不易感小鼠，均显著上调了心脏的IL-17A及 IL-17RA水平，并显著上调了 IL-17A/IL-17RA通路下游的首要效应----中性粒细胞趋化因子 CXCL1/CXCL2的表达及中性粒细胞数目在脾脏和外周血的显著上调。IL-17A与IL-17RA均分别具有促进CVB3病毒性心肌炎的功能，且该功能均与中性粒细胞的组织浸润有关联。清除试验证实了中性粒细胞具有一定的促进炎症和清除病毒的效果。本研究提示中性粒细胞被 CVB3感染所显著动员（外周血绝对数增加、组织浸润增加），并在心脏组织浸润和心肌炎发生当中扮演不可忽视的作用。