背景与目的外伤性蛛网膜下腔出血(traumatic subarachnoid haemorrhage,TSAH)是一种不同于与脑挫伤所致的蛛网膜下腔出血和病理性蛛网膜下腔出血的独立脑蛛网膜下腔出血,与外伤性硬脑膜外出血、硬脑膜下腔出血并列为外伤性颅内三大腔隙出血。国内外学者报道的TSAH常与酗酒有关。本课题组的前期工作已建立了急慢性灌酒后大鼠TSAH模型,实验结果显示:灌酒后大鼠TSAH出血率:急性组28.6%、慢性组82.4%,死亡率:急性组0、慢性组58.8%,提示慢性灌酒TSAH死亡率远大于急性灌酒组,从脑组织Ngb、Hif-1α、Na+,K+-ATPase等氧和能量代谢、tPA和MMP-9等血管壁和神经细胞毒性、血管形态结构及其生物力学三个方面,探讨了饮酒促发TSAH的发生机制,特别是发现了暗神经元细胞。但是,尚不清楚慢性灌酒大鼠TSAH高死亡率,是否与这些暗暗神经元细胞有关及其与死亡机制的关系。而这正是TSAH死亡案件的法医学鉴定和死因分析,及其司法审判量刑的一个重要而迫切的问题之一。由于Cyt-C→Caspase-9→Caspase-3三者是一条重要凋亡通路,与脑功能状态密切相关,因此,本研究旨在前期建立的大鼠灌酒后TSAH模型基础上,进一步观察脑组织Cyt-C、Caspase-9、Caspase-3表达及其与脑干神经核暗细胞的关系,从分子生物学、毒理学及形态学角度探讨慢性灌酒后大鼠TSAH死亡机制。材料与方法1动物及分组:雄性SD大鼠80只,体重300~400g,常规分笼饲养,随机分组。1.1急性灌酒模型:40只大鼠随机分灌酒组,一次性胃内灌酒(北京红星酒厂二锅头,52%v/v)15 ml/ kg;灌水组灌胃同等计量的食用自来水。再分别于灌酒或灌水后2 h,给予脑震荡性打击,建立灌酒打击组和灌水打击组模型,每组各10只。1.2慢性灌酒模型:40只大鼠随机分灌酒组和灌水组,给予胃内灌酒(北京红星酒厂二锅头,52%v/v)或灌水四周,均每天9:00和15:00间隔6小时灌两次,前2周每次灌8 ml/kg、后2周每次灌12 ml/kg。再分别于最后一次灌酒或灌水后2 h,给予脑震荡性打击,建立灌酒打击组和灌水打击组明显,每组各10只。2方法各灌酒或灌水打击组大鼠,均于打击后0.5 h,开胸暴露心脏,经左心室-主动脉插管,灌注4%中性多聚甲醛液处死兼固定,剪开右心耳放血。约0.5 h后开颅取全脑,水冲洗后,置于4%中性多聚甲醛固定6小时,脱水、浸蜡、包埋,常规制作石蜡组织切片厚约5 um,分别HE染色观察脑组织形态、暗神经元数量变化;Cyt-C、Caspase-9、Caspase-3免疫组织化学染色,观察3种因子表达情况。真彩色病理图像分析系统(版本4.0)进行体视量化病理组织学观测。实验数据用SPSS13.0统计软件进行分析处理(Independent-samples T-test and One-way ANONA)。结果1血酒精浓度变化和行为学表现急性灌酒后2 h时大鼠血酒精浓度114.67±67.37 mg/dL,灌酒后短时间内,大鼠兴奋性较强、步态不稳,不停靠墙走动;0.5 h后逐渐出现侧卧、翻正反射消失、昏睡、呼吸缓慢等急性酒精中毒表现;2 h后呼吸频率63.5±9.4次/分和血压106.1±4.6 mmHg均较灌酒前85.1±9.3次/分和133.8±5.5 mmHg显著下降(P<0.01)。单纯灌水组灌水前后血压、呼吸无明显变化。急性灌酒打击组和灌水打击组大鼠,打击后0.5 h血压121.1±17.6 mmHg较打击前106.5±10.1 mmHg明显升高(P<0.05),呼吸频率未见明显改变。慢性灌酒组大鼠饲养期间逐渐出现毛发粗糙发黄、无光泽、精神萎靡、两眼无神、进食量减少、基础血压升高、体重增长缓慢或下降等。2周后体重为372.8±22.2 g较灌酒前的389.7±31.7 g明显下降(P<0.05);灌水组大鼠第4周体重为405.1±20.8 g较灌水前的390.1±24.7 g增长明显(P<0.05);大鼠灌酒后第四周基础血压为152.3±13.5 mmHg较灌酒前的135.0±11.2 mmHg上升(P<0.05),最后一次灌酒后血压为140.3±10.4 mmHg较灌酒前的152.3±13.5 mmHg低(P<0.05),打击后升高为151.2±10.6 mmHg (P<0.05)。灌水打击组打击后血压为148.1±13.5 mmHg较打击前137.1±12.6 mmHg高(P<0.05)。单纯灌水组大鼠基础血压未见明显改变。灌酒和灌水组大鼠基础呼吸频率均未发生变化,仅每次灌酒后出现呼吸频率降低(P<0.05),打击后呼吸频率未见明显改变(P>0.05)。2 TSAH、SAH发生率、死亡率及病理学观察急性灌酒打击组大鼠TSAH发生率20%,无死亡。慢性灌酒打击组的TSAH发生率50%,死亡率约40%。急慢性灌水打击组均未发现TSAH。急性单纯灌酒对照组1只出现自发性SAH。急性单纯灌水组大鼠脑表面光泽,表面散在细小血管纹理,未见暗神经元细胞。急性灌水打击组大鼠脑表面较苍白,细小血管纹理细少或消失,未见暗神经元细胞。急性单纯灌酒组脑表面光泽,斑片状淤血,发生自发性SAH的脑干腹侧薄层斑片状蛛网膜下腔出血。急性灌酒打击组大鼠TSAH呈薄层斑片状出血,主要分布在脑干腹侧面,脑组织神经元轻度水变性、细胞周隙略扩大,偶见固缩深染的暗神经元细胞、尼氏小体消失。慢性单纯灌酒组大鼠脑表面光泽,散在淤血,可见散在暗神经元细胞,呈暗紫红色均质化、胞体皱缩、胞浆及胞核浓缩,核不清或消失,轴突不规则扭曲,多见嗜神经现象。慢性灌酒打击组大鼠发生TSAH的脑表面大片较厚层蛛网膜下腔出血,主要分布在脑干腹侧面,神经元及胶质细胞中度水变性、细胞周隙明显扩大、尼氏小体消失,多见散在暗神经元细胞。3 Cyt-C、Caspase-9、Caspase-3的表达急性灌水打击组大鼠神经元胞浆Cyt-C、Caspase-9、Caspase-3均表达较弱,阳性细胞数分别为7.0±1.83、6.8±1.54、6.7±1.13,各脑区之间无差异(P>0.05)。急性灌酒打击组Cyt-C、Caspase-9、Caspase-3的IOD值3550.6±285.69、3061.5±365.14、2950.5±266.76高于急性灌水打击组的1875.7±297.05、1606.6±225.18、1675.7±295.82 (P<0.05)。急性单纯灌水组和急性灌水打击组之间以及急性单纯灌酒组和急性灌酒打击组之间阳性细胞数和IOD值无差异(P>0.05)。慢性单纯灌酒组大鼠神经元Cyt-C、Caspase-9、Caspase-3阳性细胞数20.58±5.26、15.2±3.61、15.8±3.80和IOD值3871.9±248.82、3397.3±373.22、3401.7±305.57均高于慢性单纯灌水组的6.7±1.85、6.8±1.55、6.3±0.91和1838.9±238.71、1692.4±273.98、1674.7±241.04(P<0.01)和急性单纯灌酒组的12.4±3.31、9.0±2.15、10.9±2.48和3448.3±297.48、2920.6±230.96、2844.8±240.61(P<0.05);慢性灌酒打击组大鼠神经元Cyt-C、Caspase-9、Caspase-3阳性细胞数22.78±5.63、17.3±3.56、18.1±3.99和IOD值4182.4±289.90、3826.3±378.04、3728.6±300.77均高于慢性单纯灌酒组的20.58±5.26、15.2±3.61、15.8±3.80和3871.9±248.82、3397.3±373.22、3401.7±305.57(P<0.05)和慢性灌水打击组的8.1±2.0、6.7±1.62、6.8±1.40和1891.43±300.62、1681.6±224.36、1686.5±280.03(P<0.01)。4暗神经元的表达急性灌酒组大鼠脑组织偶见暗神经元,灌水组未见暗神经元;慢性灌酒打击组大鼠脑组织暗神经元数量为10.5±2.24多于慢性单纯灌酒组的9.0±2.29 (P<0.05)。暗神经元的面积1204.8±390.82 um2小于正常神经元的1905.8±913.71 um2 (P<0.05),周长和平均直径分别为138.02±19.36和41.76±6.06均较正常神经元的167.07±41.03和50.56±12.10短(P>0.05)。结论1、急慢性酒精中毒可致明显外伤性蛛网膜下腔出血的发生,尤其是慢性酗酒的TSAH发生率及死亡率均高于急性醉酒的,提示酗酒者TSAH案件的法医学分析,应考虑慢性酗酒神经中枢毒理性因素,酗酒与轻微头颈部外力打击应属于协同死因。2、急慢性酒精中毒可引起脑组织Cyt-C、Caspase-9、Caspase-3表达增强,与暗神经元的发生之间存在关联性,特别是慢性酒精中毒脑组织暗神经元数量明显增多,提示酒精及其代谢产物可激活Cyt-C→Caspase-9→Caspase-3凋亡途径,参与CNS暗神经元的形成,及酒精性脑萎缩、酒精性脑病等形态和功能障碍。3、从原因、形态和机制各方面表明中枢神经系统的暗神经元不同于一般的组织细胞萎缩性病变,可能为细胞凋亡的早期过渡状态,为一种可逆性病理变化,可能构成慢性酒精中毒及其TSAH高死亡率的神经病理学基础,进而参与其死亡机制。