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研究背景一直以来,肿瘤都是威胁人类生命的头号杀手,但在近几年来,肿瘤免疫疗法逐渐应用到临床治疗当中,取得了令人瞩目的成果。而随着生物信息学与免疫学的不断发展融合,利用肿瘤抗原预测HLA-A2限制性的CD8+CTL表位,进而构建多肽疫苗成为大家关注的一大领域。在这方面,如何选择合适的抗原成为重中之重。目前该领域所选用的抗原大多为肿瘤自身所表达的,而本文选用表达在肿瘤基质中的特异性抗原成纤维细胞激活蛋白(Fibroblast Activation Proteina,FAP)来进行筛选和鉴定。FAP表达在肿瘤相关成纤维细胞(Cancer-associated Fibroblasts,CAF)中,1986年首次发现,1990年正式命名为FAP,属于II型丝氨酸蛋白酶家族。FAP表达于90%以上的上皮性肿瘤的基质成纤维细胞的胞膜和胞质中,而在正常的成纤维细胞中几乎不表达,是一个特异性非常强的肿瘤诊断和治疗的靶点。其参与了多种肿瘤发生发展过程,如促进肿瘤原发灶的形成、帮助肿瘤细胞发生侵润和转移,以及近几年发现的具有抑制肿瘤免疫的作用,引起了人们极大的兴趣。因此本研究选取FAP作为靶抗原进行表位鉴定和免疫原性的研究。研究目的本文的研究目的是通过多种生物信息学软件预测,并通过一系列体内外实验,筛选并鉴定来源于FAP的HLA-A2制性的CD8+CTL表位,检测其免疫原性,为以后多肽疫苗构建应用的可行性提供一定的理论研究基础。研究方法首先,我们通过在线免疫信息学软件SYFPEITHI,BIMAS, NetCTL对FAP进行了HLA-A2限制性表位预测。Fmoc固相合成预测出的打分较高的候选表位肽,反相高效液相色谱法纯化,并对其进行质谱鉴定。纯化出的表位肽首先通过结合力和稳定性实验进行初步筛选,得到高亲和HLA-A2分子且稳定性较好的表位肽。之后进行体外和体内免疫活性检测,主要是通过ELISPOT实验、胞内因子染色实验检测诱导的特异性CD8+ CTL分泌IFN-γ的情况,LDH靶细胞杀伤实验检测所诱导的特异性CD8+ CTL对靶细胞的杀伤作用。然后进行HLA-A2.1/Kb转基因小鼠动物实验。建立免疫模型,制取小鼠脾脏和腿部淋巴结细胞,体外诱导培养后,通过ELISPOT实验、胞内因子染色实验(ICS)以及LDH靶细胞杀伤实验,分析各候选表位肽对转基因小鼠CTL的诱导激活能力。同时收取小鼠外周血血清以及脾脏和腿部淋巴结细胞培养基测定其IFN-γ含量,形成较完整实验体系。研究结果利用在线预测工具我们初步选定了8条表位肽,Fmoc固相合成,反相高效液相色谱仪纯化。质谱鉴定分子量正确。进一步的结合力实验表明来源于靶蛋白的三个表位P120 (Lys-Leu-Trp-Arg-Tyr-Ser-Tyr-Thr-Ala), P265 (Phe-Ile-Ile-Asp-Thr-Thr-Tyr-Pro-Ala), P639 (Gly-Leu-Phe-Lys-Cys-Gly-Ile-Ala-Val)能够形成对HLA-A2分子的高效亲和及较好稳定性,结合力指数分别为：0.66,1.13,1.25,稳定性分别为>4h,>6h,>6h。选定其进入后续免疫活性分析实验。收集3例健康HLA-A2+志愿者外周血,分离单个核细胞,并用以上表位肽进行诱导形成表位特异性CTL,之后以荷载相应表位肽的T2A2细胞为靶,与CTL共孵育,ELISPOT实验检测分泌IFN-γ的CTL频率。结果显示,三条候选表位肽在HLA-A 2+供者中刺激产生了较多IFN-γ阳性的CTL。LDH靶细胞杀伤实验表明P120,P265,P639比较有效的激活了CTL对靶细胞的杀伤,在同一效靶比下,杀伤率显著高于阴性对照组。胞内因子染色实验检测了CD8+CTL释放IFN-γ,的情况,结果表明这三条肽均能很好的诱导刺激CD8+CTL释放IFN-γ。其中P639组中IFN-γ+的CD8+CTL比例为9.70%,效果最好,而P120和P265组中相应细胞比例分别为2.62%和3.47%。而在HLA-A2.1/Kb转基因小鼠实验中,我们发现无论是ELISPOT、LDH以及胞内因子染色实验均与用人外周血分离得到PBMCs诱导CTLs实验结果基本保持一致。并且又通过ELISA实验检测了小鼠外周血血清以及脾脏、淋巴细胞培养基的IFN-γ水平。在P120,P265,P639实验组诱导的小鼠外周血血清中,IFN-γ的含量分别为337.97pg/mL,876.99 pg/mL,534.52 pg/mL。而Th表位对照组和PBS阴性对照组的IFN-γ含量仅为234.38 pg/mL,187.64 pg/mL。而经P120, P265, P639诱导刺激5天的CTL培养基上清中,ELISA实验检测发现大量的IFN-γ,达到微克级,其含量分别为：3706μg/mL,54.25μg/mL,46.70μg/mL同样,Th表位对照组和PBS阴性对照组的IFN-γ含量分别仅为24.20μg/mL 19.60μg/mL,二者有显著差异。同时,我们在整个实验过程中记录了小鼠体重的变化和主要脏器指数,以初步观察这些表位肽是否有毒副作用。最终结果显示与各对照组相比,在实验期间,实验组小鼠体重基本保持一致,而脏器指数也趋于稳定(P>0.05),初步表明候选表位肽对小鼠并无明显毒副作用。研究结论综上所述,通过一系列体内外实验,最终我们筛选得到三条FAP来源的HLA-A2限制性的CD8+CTL抗原表位,分别为P120,P265,P639。实验结果表明,这三条肽均可在一定程度上激活免疫反应,并且其皆具有一定的体内免疫活性。