论文部分内容阅读
SWEET(Sugars Will Eventually be Exported Transporters)蛋白是近年来鉴定的一类新型糖转运蛋白,可以选择地将单糖或者二糖通过质膜或者细胞内膜进行转运,在植物发育和胁迫反应中发挥关键作用。SWEET蛋白能从受感染的细胞中引起糖泄露从而使植物易感于病原菌。目前为止,SWEET基因已经在拟南芥、水稻、番茄、棉花、烟草、马铃薯、大豆、梨等物种中被鉴定,然而在桑树中还未有相关的报道,在桑树胁迫反应中发挥的作用也尚未知晓。另外,在本研究小组前期对易感桑椹菌核病品种和抗病品种的转录组测序比较分析发现部分SWEET基因与果桑菌核病的抗性有密切联系。基于以上考虑,本研究通过生物信息学的方法,利用川桑数据库全面鉴定了SWEET基因,对其基因结构、跨膜结构域和系统进化关系进行了分析。通过荧光定量PCR分析了SWEET基因在青果、病果和红果桑椹的表达模式,并选择MaSWEET4和MaSWEET15为后续研究对象。构建MaSWEET4和MaSWEET15过表达载体,以农杆菌为介导转入烟草中进行异源表达,成功获得了3株MaSWEET4过表达转基因烟草株系和4株MaSWEET15过表达转基因烟草株系。检测阳性转基因株系中防御相关基因的表达量,对MaSWEET4和MaSWEET15响应胁迫机理进行探究。获得的主要研究结果如下:1、桑树SWEET基因的鉴定及生物信息学分析以拟南芥SWEET基因为参考,在川桑数据库中鉴定到15个SWEET基因家族成员。所有的桑树SWEET蛋白均含有两个MtN3/Saliva结构域,并至少包含一个跨膜α-螺旋结构域(α-helical transmembrane domain,TM)。在基因结构和蛋白基序分析时发现SWEET蛋白具有高度保守性。大多数SWEET基因都具有6个外显子,而且几乎所有的SWEET蛋白都具有Motif1-5。亲缘关系较近的SWEET基因还具有相似的基因结构及基序组成。对其跨膜结构域进行预测,结果显示11个SWEET蛋白都具有典型的7次跨膜α-螺旋结构域7-TMs,表明绝大多数桑树SWEET蛋白是典型的SWEET蛋白。系统发育分析中,桑树与拟南芥、水稻以及葡萄的SWEET蛋白明确地分为了四个进化枝。这四个进化枝与拟南芥SWEET蛋白四个已知的进化枝一一对应。2、桑树SWEET基因的表达谱分析通过荧光定量技术对桑树SWEET基因在不同品种的不同桑椹组织中的表达特异性进行分析。在不同组织中,各个MaSWEET基因的表达水平差异较大。MaSWEET4在嘉陵40号病果桑椹组织的表达量最高,但在红果桑椹却几乎不表达。相反,MaSWEET15在嘉陵40号红果桑椹表达量最高,在病果桑椹组织中却几乎没有表达量。MaSWEET4和MaSWEET15在病果和红果桑椹截然相反的表达模式在嘉陵30号品种也有被观察到。而且,在三个品种的红果桑椹除了MaSWEET15表达量最高外,其余绝大多数SWEET基因的表达量都比较低。另外,MaSWEET17a在长果桑青果桑椹表达量最高,但在红果桑椹表达量却极低。同样地,在嘉陵40号和嘉陵30号青果桑椹表达量都比较高的MaSWEET17a却在对应品种的红果和病果桑椹表达量都很低,这些结果表明SWEET基因的表达模式具有一定的相似性。3、桑树MaSWEET4及MaSWEET15的转基因过表达分析构建MaSWEET4及MaSWEET15的过表达载体,通过叶盘法在烟草中进行异源过表达,获得了3株MaSWEET4阳性转基因烟草和4株MaSWEET15阳性转基因烟草。对阳性转基因烟草株系防御相关基因的表达量进行检测,结果显示MaSWEET4转基因株系中病程相关(Pathogenesis-related,PR)基因PR2、防御素(Plant defensin,PDF)基因PDF1.2、乙烯应答因子(Ethylene-responsive factor,ERF)ERF1、蛋白酶抑制剂(Proteinase inhibitor,PI)基因PI1及过氧化氢酶(Catalase)基因CAT的表达量均显著低于野生型烟草。而在烟草中过表达MaSWEET15,显著提高了PR2和PR3的表达水平,ERF1、PI1、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase)基因SOD和WRKY12的表达量也高于野生型烟草。这些结果表明在植物病原菌防御反应过程中MaSWEET4可能是负调控因子,而MaSWEET15可能是正调控因子。