研究背景及目的《中国心血管疾病报告2018年》报道目前我国心血管疾病人数及占比均居前列,心血管病患者约29,000万人冠心病患者。农村病死率持续增高,特别是急性心肌梗死(AMI)近10年死亡率已超过城市。冠心病介入治疗较以往上升13%,因此造成巨额医疗费用。研究发现30%冠脉狭窄程度40%-70%的患者可以伴有心肌缺血,35%狭窄程度50%-70%缺血患者FFR≤80%。对于接受冠脉造影经皮冠脉介入术治疗(PCI)的患者病史研究,7/8病患者发病前造影报告狭窄程度处于中度狭窄范围(30%-70%),6%患者在一年内发展为急性病变。这个范围被目前医学界暂定为冠脉临界病变型冠心病。冠脉临界病变是指冠状动脉脉造影(Coronary angiography,CAG)直径法测定冠脉中度狭窄(30%-70%)的病变,是冠状动脉粥样硬化进展过程中的一个特殊阶段,发病机制、病理特点、现代治疗、中医诊疗同冠心病(CHD)一致。研究表明冠脉临界病变常见的主要中医证型为痰湿、热蕴、血瘀三者的组合证型。本研究通过采集化痰活血清热方治疗冠脉临界病变痰瘀热证临床试验受试者血样,进行高通量测序及生物信息学分析,找到病证结合、化痰活血清热方治疗的基因差异表达谱。同时以病证结合动脉粥样硬化为切入点,探索化痰活血清热方治疗的分子机制。研究方法1临床文献研究本研究以冠心病痰瘀热证病证结合模式,制定相应的检索语言,检索知网、CBM、维普、万方4大中文数据库自建库至2019年12月发表所有符合疾型的相关临床报道(临床试验研究和名家临床经验)。提取文献基本特征、证治处方、经典溯源,结合《伤寒杂病论》,对所属关联方剂进行方证对应、组方配伍探讨。2化痰活血清热方经方用量配伍研究在上述基础上,结合张仲景《伤寒杂病论》经方及经典条文,对化痰活血清热方相关药物进行分析,发现药对配伍规律,总结应用特点,找到相关药对及配伍的主治功效,为化痰活血清热方临床应用提供一定依据。3HHQ网络药理学研究TCMSP、Pubchem、SwissTargetPrediction、UniProt预测化痰活血清热方有效调节靶标。TTD、DrugBank、DisGeNET获取冠心病靶标。Gen eCards获得动脉粥样硬化(AS)mRNA。Cytoscape3.2.1的ClueGO和C lusterONE进行分析,得到核心靶标参与的具有统计学意义(P<0.01)的通路信息。以有效成分、预测交集靶标、作用通路及通路注解为节点(node),运用Excel表格建立对应关系,导入Network Analyzer,根据关键拓扑参数自由度(degree)和介数(betweenness),构建化痰活血清热方-冠心病动脉粥样硬化的“成分(miRNA)-靶标-通路”网络图,通过全面形成“成分-靶标-通路”网络,发掘化痰活血清热方治疗冠心病动脉硬化多靶标、多途径、多层次的作用。中药成分与预测靶标的关系用特殊颜色标识,通过构建“成分-靶标-信号通路”可视化网络图,为实验室研究提供一定依据。4差异表达谱研究收集冠脉临界病变痰瘀热证治疗组(疗前、后)、冠脉临界病变痰瘀热证安慰组组(疗前、后)、冠脉临界病变非痰瘀组、正常组共30例外周血有核细胞样本,运用高通量测序技术检测其miRNA、mRNA的表达量,综合分析治疗前冠脉临界病变痰瘀热证(实验组、安慰组)与正常组、冠脉临界病变非痰瘀热组的比较,分析冠脉临界病变痰瘀热型治疗组自身对照(后、前)、冠脉临界病变痰瘀热型安慰组自身对照(后、前),通过生物信息学手段对筛选的差异表达基因进行关联分析,获得冠脉临界病变痰瘀热证miRNA、mRNA差异表达谱,及化痰活血清热方治疗冠脉临界病变痰瘀热证miRNA、mRNA差异表达谱。5HHQ治疗病证AS分子机制研究探究化痰活血清热方治疗冠脉临界病变痰瘀热证AS相关miRNA、mRNA的作用机制。得到化痰活血清热方治疗冠脉临界病变痰瘀热证差异基因表达谱,运用GeneCards数据库,检索获得斑块(atherosclerosi s)相关的mRNA、miRNA,结合化痰活血清热方预测治疗靶点,三部分交集认为是化痰活血清热方治疗冠脉临界病变痰瘀热证AS的关键基因,运用聚类分析、主成分分析(PCA)、GO通路和KEGG通路分析。miRBase和starBase数据库比对注释测序结果,通过分析获得基因调控关联,构建化痰活血清热方治疗冠脉临界病变痰瘀热证miRNA与mRNA调控网络。结果1临床文献分析分析符合纳入/排除标准的49篇文献,学位论文16篇,期刊论文33篇,最早年份2000年,最新年份2019年,明确与仲景学术相关的四物汤(桃红四物汤)、血府逐瘀汤、温胆汤(黄连温胆汤)、二陈汤、柴胡陷胸汤、小陷胸汤、瓜蒌薤白半夏汤,分析原方证治内涵;结合仲景经方胶艾汤、四逆散、半夏茯苓汤、橘皮竹茹汤、小柴胡汤、小陷胸汤、瓜蒌薤白半夏汤,追溯方证解析。归纳冠心病痰瘀热证增多与肥胖、活动量下降、不良饮食作息等相关,是以血瘀证为核心,痰热证为主体正虚邪实的复杂疾病,与肝肾精血亏虚密切相关。因此,在活血化瘀、清热化痰的同时应当注意酌情扶正补虚,调培肝肾。2化痰活血清热方仲景学术配伍研究根据归纳,发现五味中药汤剂应用中,配伍黄连的经方14首,配伍半夏的经方44首,配伍芍药的经方50首,配伍葛根的经方5首,配伍人参的经方38首。5味中药存在配伍关系的经方有32首,汤剂应用中,配伍黄连的常用剂量为一两(57.14%);配伍半夏的常用剂量为半升(78.26%),配伍芍药的常用剂量为二两、三两(45.45%),配伍葛根的常用剂量为四两(40%),配伍人参的常用剂量是三两(42.11%)。在治疗冠心病时,“黄连-半夏”增强清热和胃、燥湿化痰,“人参-半夏”增强扶正祛邪、和中降逆,“黄连-人参”泻实补虚、益气祛邪,“葛根-芍药”增强通络除痹、活血化瘀。3化痰活血清热方治疗冠心病AS网络药理学分析网络分析表明,化痰活血清热方治疗冠心病AS是通过129个治疗成分调控82个靶标,通过GEO2R在线多个基因芯片分析,靶标存在上下调差异,上调靶标35个,下调靶标47个,作用于12个生物过程、54条具体通路。结论:化痰活血清热方治疗冠心病AS的机制可能是通过8味中药调控PTGS2、MGLL、PDGFRA、PPARG、NR1H3、PPARA、T NF、SCARB1、IL1B、VDR、NFKB1、LDLR、IL6、APOB,参与有脂类及脂蛋白的合成与代谢、凝血功能、NO生物合成过程、炎症反应、脂多糖反应、序列特异性DNA结合转录因子活性的正向调控、对外界刺激反应的负调控、生物稳态等等信号通路发挥作用。4冠脉临界病变痰瘀热证及化痰活血清热方治疗的mRNA、miRNA差异表达谱高通量测序技术及生物信息学方法获得冠脉临界痰瘀热证基因差异表达谱包括mRNA有557个(249个上调,308个下调),miRNA有162个(已知的28个上调、新发现37个上调、已知的38个下调、新发现59个下调)。高通量测序技术及生物信息学方法获得冠脉临界痰瘀热证基因差异表达谱包括mRNA有54个(38个上调,16个下调),miRNA有33个(已知的4个上调、新发现17个上调、已知的5个下调、新发现7个下调)。5化痰活血清热方治疗冠脉临界病变痰瘀热证AS分子机制化痰活血清热方治疗冠脉临界病变痰瘀热证AS相关mRNA有9个、未发现miRNA,通过反向匹配获得差异表达miRNA为9个,进一步结合化痰活血清热方有效成分预测靶标,发现经过实验确证的关键m RNA为3个,有PTGS2、MGLL、PDGFRA,反向寻找靶向关系调控m iRNA,比对治疗前目标miRNA差异表达,获得5个新的miRNA(4个上调,1个下调),2个已知miRNA(1个下调,1个上调),分别是n ovel1020_star上调、novel1404_mature上调、novel1978_mature下调、no vel295_mature上调、novel926_mature上调、hsa-miR-8485下调、hsa-mi R-210-5p上调均有显著性统计学差异(P<0.05),发现相关有效成分77个。Funrich软件、GO通路、KEGG通路富集分析发现差异表达基因参与8个生物过程(BP)、8个分子功能(MF)、12个细胞组分、39个具体信号通路,运用Cytoscape3.2.1软件构建分子机制通路图。结论当前冠心病存在痰瘀热证型,同时主要矛盾为正虚邪实,化痰活血清热方治疗冠脉临界病变痰瘀热证疗效显著。从仲景学术角度切入,化痰活血清热方治疗冠心病主要药对及功效为“黄连-半夏”清热和胃、燥湿化痰、“人参-半夏”扶正祛邪、和中降逆,“黄连-人参”泻实补虚、益气祛邪,“葛根-芍药”通络除痹、活血化瘀。从mRNA、miRN A的基因差异表达谱上获得冠脉临界病变痰瘀热证分子生物学特征,同时从分子层面揭示化痰活血清热方治疗冠脉临界病变痰瘀热证动脉粥样硬化相关miRNA-mRNA调控关系,并形成“中药-成分-miRNA-mRNA-通路-疾病”可视化网络。化痰活血清热方治疗冠脉临界病变痰瘀热证“成分-miRNA-mRNA-通路-疾病”的探索研究,为今后开展此类研究提供一定基础。