论文部分内容阅读
肝脏由胚胎内胚层演变而来，胚胎期肝具有重要的造血功能。人胚6周，造血干细胞(hematopoietic stem cell，HSC)从卵黄囊迁入肝，即进入了肝脏造血期。胎儿15～24周，是肝造血的旺盛期。胎肝造血以红细胞系占绝对优势，也有粒细胞系不同发育阶段的细胞，还有淋巴细胞和巨核细胞。红细胞系中以中幼红细胞的数量最多，粒细胞系数量少，出现也晚。至胚胎6月肝脏造血逐渐减弱，到出生时由骨髓造血所取代。 胃肠道内分泌细胞分泌的血管活性多肽(Vasoactive Intestinal peptide，VIP)具有多种生物学功能，当其随门静脉血流进入肝脏后，与肝细胞上的相应受体结合，内在化后被溶酶体降解，很快被清除。因此，肝脏是灭活VIP的主要场所。肝脏局部的VIP及受体对肝脏造血及造血器官的迁移起了何种作用?对造血干细胞在肝脏的横向分化有何影响也令人感兴趣。为回答以上问题，我们探讨了VIP对造血干细胞生物学行为的影响及机制。 目的 1．探讨VIP对人HSC体外增殖及集落形成的影响，以及可能机制； 2．VIP对人HSC向造血系细胞分化的影响； 3．VIP对人HSC向肝系分化的影响及可能机制，解释VIP对HSC横向分化的可能影响； 4．通过胎肝发育中VIP及VIPR含量的变化，初探胎肝造血转移机制； 5．VIP是否通过HSC上的相应受体介导发挥上述作用，HSC上VIP受体为何种亚型?重庆医科大学博士学位论文方法1.采集人脐血标本，淋巴细胞分离液分离出单个核细胞;2.免疫磁分选技术纯化人脐血CD34十细胞，流式细胞术鉴定纯度;3.体外集落形成实验检测V正对人HSC集落形成能力的影响;4.扩增培养计数VIP对CD34+细胞增殖影响;5.酶联免疫化学法测定培养HSC细胞及上清TNF-a、TGF-B水平，以及A万P水 平;6.流式细胞术检测CD34+细胞培养过程中各系分化细胞比例;7.免疫组织化学法检测 HSC上肝系标志AFP、ALB、CK-19的表达;8·Westem blot方法检测Hse上ALB表达;9.巢式RpPCR方法检测HSC上AFP、ALB的mRNA表达，随机选送ALB产 物测序;10.采集发育不同期SD大鼠肝脏标本;11.生物分子相互作用系统(Biacore)测定人HSC、肝脏组织vIPR结合力;12.放射免疫法检测肝脏组织VIP浓度水平;13.Rl’- PCR方法检测人HSC、肝脏组织VIPR的mRNA表达。结果1.vIP在10一7m。呱一10一‘2 mof几浓度范围内可抑制造血干细胞集落形成(抑制率 )26.97士13.72%)，P<0.05;在10一8 mol/L抑制作用最大。10·8 moULv护作用 下HSC扩增倍数第7、10、14天分别依次为1 1 .78士4.39、16.71士2.98、21.69 士3.28倍，显著低于对照组(20.13士3.32、25.64士3.51、25.33士2.61)，P<0.05。2.vIP作用于HSC后，细胞内TNF一a浓度为149.15p创ml，较对照组显著升高， P<0.05，增加T 49%;V正显著增加T HSC内TGF一B，浓度，为116.lop岁ml， 较对照组升高44.41%，P<0·05。重庆医科大学博士学位论文3.1护mo呱的v正作用Hse 14天后，粒系eD13细胞比例为50.33%，对照组 为93.35%，有显著降低，P<0.05;7天组、14天组单核系CD14细胞比例分别 依次为8.20%和15.巧%，对照组分别依次为13.80%和22.55%，也有显著降低， P<0.05。红系CD71+细胞、巨核系CD41+细胞、B淋巴细胞CD19+细胞、T淋 巴细胞CD4/CDS细胞、祖细胞CD33+细胞在VIP作用前后均无显著性差异， p>0.05。v正作用于CD34细胞7天后，CD34+细胞比例较对照组(18.乃%)明显 增加(22.0%)，P<0.0504.免疫组化结果显示人HSC上不表达CK一19蛋白，但有ArP和ALB蛋白表达; VIP作用HSC 14天后，HSC内的AFp浓度(165士8.51 Pg/ml)较对照组(270土 11.37p留ml)显著下降，P<0.05。western blot显示v正作用后Hse内ALB蛋 白表达有减弱趋势。人脐血单个核细胞和CD34+细胞都表达了AFP mRNA和 A工B mRNA，随机选取ALB产物测序与Genebank中ALB基因序列完全相同。5.从胚胎到新生鼠，肝脏vIP量(分别为1349.18士220.37n岁加l，2439.64士394.22 ng/ml)与V正受体表达量(分别为806.67士58.47 RU/ug蛋白，952.5士121.45 RU/ug蛋白)均呈增加趋势;出生后，从未成年期到成年期肝脏vIP量(分别为 2689·47士227·53ng/ml，1911.79士453.15 ng/ml)与V护受体表达量(分别为 762.5士97.15 RU加g蛋白，425士119.38 RU/ug蛋白)都逐渐降低，即出生前后 呈相反的变化趋势。值得注意的是，新生期VIP量低于未成年期，但VIP受 体表达量却正相反。Rl’- PCR显示大鼠发育不同时期肝脏都表达VIP受体1型。6.生物分子相互作用系统显示人造血干细胞表达 vIPR，结合量为2366.67 RU枷g 蛋白;Rl’- PCR显示人脐血造血干细胞和单个核细胞表达V正R一1 mRNA。结论1.VIP可抑制人造血干细胞增殖和集落形成，是一种新被认识的造血抑制剂。2.V砰抑制人造血干细胞增殖的机制之一是通过上调HSC内造血抑制因子 TNF一a、TGF一B水平实现的。 重庆医科大学博士学位论文3.VIP抑制造血干细胞向粒单系分化，对其向红系及其它系分化无影响;VIP从 时间上减缓CD34抗原消失，