氨基甲酸乙酯(Ethyl carbamate,EC)是一种广泛存在于发酵食品和酒精饮料中,由EC前体与乙醇自发反应而形成的2A级致癌物。酱油发酵是一个混菌发酵过程,目前其EC主要前体及形成途径尚未得到解析,造成无法制定有效的EC消除策略。因此,探寻酱油发酵过程中与EC前体形成相关的关键微生物,并阐释EC前体的生成与微生物代谢途径的关联性,明晰酱油中EC的形成途径,对于控制或减少酱油中EC含量具有重要的意义。本论文通过研究酱油中EC的前体及其形成规律,探索了EC的形成机制及其消除策略。本文主要研究结果如下:(1)通过测定不同工艺生产的酱油中EC含量,确定了EC主要是在灭菌阶段生成,尤其是在添加酵母的日式酱油生产工艺中产生量较大。经EC前体反应模拟实验,证实酱油中EC的主要前体是瓜氨酸,以及瓜氨酸积累时期为酱油乳酸发酵和乙醇发酵时期。乳酸发酵时期瓜氨酸积累了1.38 g?L-1,占总量的69%,是主要积累时期。根据酱醪中瓜氨酸的积累时期及积累特点,建立了产瓜氨酸菌株的高通量定向筛选方法,成功地从成曲和酱醪中高效分离到了10种瓜氨酸的积累细菌。同时发现酱油发酵过程中外源添加的用于增香的鲁氏接合酵母(Zygosacchromyce rouxii)ZQ02与乳酸发酵时期瓜氨酸浓度的降低相关,而用于产醇的Z.rouxii ZQ01与乙醇发酵时期瓜氨酸的积累相关;(2)通过分析外源添加的两株用于酱油生产的鲁氏接合酵母Z.rouxii ZQ01和Z.rouxii ZQ02的氮源利用特性,发现两株鲁氏接合酵母在代谢过程中不利用精氨酸,表明它们不会通过降解精氨酸积累尿素和瓜氨酸;Z.rouxii ZQ02能够利用EC前体瓜氨酸和尿素,且在偏好型氮源甘氨酸、丙氨酸和天冬酰胺的存在下,对瓜氨酸和尿素的利用不受抑制,其偏好氮源甘氨酸和丙氨酸还能分别促进对尿素和瓜氨酸的利用。当环境中存在18%NaCl时,Z.rouxii ZQ02对瓜氨酸利用受到了强烈的抑制,对尿素的利用则完全被阻遏。对两株鲁氏接合酵母进行遗传特性分析,发现用于产醇的Z.rouxii ZQ01是一株杂合二倍体,用于增香的Z.rouxii ZQ02是一株杂合四倍体。Z.rouxii ZQ02的耐盐性显著高于Z.rouxii ZQ01;(3)通过比较酱油乳酸发酵时期分离菌株瓜氨酸产生能力,发现嗜酸乳酸足球菌(Pediococcus acidilactici)在盐胁迫条件下通过精氨酸脱亚氨酶途径(arginine deiminase pathway,ADI pathway)利用精氨酸并转化生成瓜氨酸是这一时期瓜氨酸积累的主要原因和形成途径。盐胁迫(18%NaCl)使得P.acidilacitci ADI途径的arc基因簇中arcA和arcB基因转录水平不等比例下调。其中arcA(编码精氨酸脱亚氨酶,ADI)下调水平低于arcB(编码鸟氨酸氨甲酰基转移酶,OTC),进而造成细胞内由ADI酶催化的瓜氨酸合成速率大于由OTC酶所催化的瓜氨酸分解速率,最终导致胞内和胞外瓜氨酸的积累;(4)通过对酱油乙醇发酵时期分离菌株瓜氨酸产生能力的分析,确定了葡萄球菌(Staphylococcus)是乙醇发酵时期主要的精氨酸利用和瓜氨酸产生菌株。但葡萄球菌在普通培养基中的精氨酸到瓜氨酸的转化率远低于在乙醇发酵时期酱醪中的转化率。通过进一步研究发现,乙醇促进酱醪中游离脂肪酸的溶解,游离脂肪酸能够造成细胞膜通透性增强,使胞内瓜氨酸释放至胞外,是这一时期葡萄球菌和其他细菌精氨酸到瓜氨酸转化率显著提高的重要影响因素;(5)基于现有的EC消除策略在酱油发酵体系中的应用具有局限性,提出了通过添加来源于酱醪并且不积累瓜氨酸却能利用精氨酸的菌株来减少和消除酱油中EC前体的研究策略。从酱油乳酸发酵末期的酱醪样品中成功筛选到了一株具有高精氨酸利用能力但又不积累瓜氨酸的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)JY06。将解淀粉芽孢杆菌JY06添加到2 L日式酱油发酵体系中,发酵结束时酱油原油中的瓜氨酸的含量从26.83 mM下降到5.13 mM,降低了81%;灭菌后酱油中的EC浓度从97.4μg?kg-1下降到16.8μg?kg-1,降低了83%。添加解淀粉芽孢杆菌JY06后,酱油中的主成分和风味没有明显的改变,成功实现了利用微生物扰动的方法消除混菌发酵体系中的EC前体,减少EC的产生。