血栓形成是心脑血管事件发生的重要原因。寻找靶向干预血栓形成环节的有效药物,对降低心脑血管事件发生率具有十分重要的意义。黄连素(berberine,BBR)是中药黄连的主要有效成分。研究发现,BBR具有抗血栓形成、降低血小板聚集与活化的作用,但BBR 口服吸收利用度极低,单次口服400mg BBR后,其血浆浓度峰值仅为0.4ng/ml,大部分以原药的形式经由粪便排泄。BBR的低生物利用度难以解释其对血栓形成的生物活性,其作用机制亟待探索。研究发现,肠道菌群是膳食依赖的心血管事件易感性的关键环节,其可产生大量代谢依赖性及非代谢依赖性的信号,直接或间接作用于机体,是外界食物及药物因素影响血栓事件发生发展的重要环节及心脑血管血栓疾病防治的重要靶点。研究证实,肠道菌群中的CutC酶能将饮食中的胆碱(Choline)代谢生成三甲胺(trimethylamine,TMA),然后在肝黄素单加氧酶3(flavin monooxygenase-3,FMO3)催化作用下生成氧化三甲胺(trimethylamine N-oxide,TMAO)。临床队列研究及荟萃分析结果证实,TMAO与心血管事件的发生密切相关,为新的独立的心血管事件危险因素,其关键机制在于TMAO导致血小板内钙离子释放增加,血小板对ADP等诱导剂反应性增强,最终导致血小板的聚集与活化。目前,针对Choline/TMA/TMAO菌群代谢通路的临床干预措施主要为菌群驱动疗法,采用的药物包括益生菌、益生元、合生元,但其临床疗效多有争议,无统一结论。此外,越来越多的证据表明,黄连的主要有效成分BBR能通过调节肠道微生态发挥保护心血管的作用。因此,基于国内外研究进展,我们提出以下假说:BBR通过调节Choline/TMA/TMAO菌群代谢通路,减少TMAO生成,进而降低血栓形成风险。为验证该假说,本课题以Choline/TMA/TMAO菌群代谢通路为靶点,从Choline向TMA转化及TMA向TMAO转化这两个TMAO生成的关键环节入手,以C57BL/6J小鼠、肠道菌群及CutC酶等为研究对象,利用厌氧菌培养、蛋白表达纯化、LC/MS等研究方法,系统研究BBR抗血栓形成的作用及潜在的分子机制。本研究分为以下几个部分:研究1菌群驱动疗法调控TMAO及其相关代谢物的Meta分析目的:系统评价菌群驱动疗法调控TMAO及其相关代谢物的有效性。方法:计算机检索Cochrane、PubMed、EMBASE英文数据库及中文期刊全文数据库、中国生物医学期刊文献数据库、中国科技期刊数据库、中医药期刊文献数据库、万方《中国学术会议论文库》、万方《中国学位论文数据库》等中文数据库。此外,手工检索会议论文集,并查阅综述类文章的参考文献补充检索。中文检索词包括“左卡尼汀or甜菜碱or三甲胺or氧化三甲胺or TMA or TMAO”and“益生菌or益生元or合生元or乳酸菌or干酵母菌”;英文检索词包括:“trimethylamine or trimethylamine N-oxide or TMA or TMAO or Betaine or L-carnitine”和“prebiotic or prebiotic or symbiotic or dried yeast or lactobacillus”。两名研究人员独立提取资料,若存在分歧则咨询第三位研究者。依据Cochrane自带的风险评价工具评价文献质量,并利用RevMan 5.3、Stata12.0Meta分析模块进行Meta分析、回归分析、发表偏倚分析等。结果:共纳入8篇英文文献,综合文献质量为高。8项研究共纳入患者258例,其中菌群驱动疗法组126例,对照组132例。研究结果显示,与对照组比较,菌群驱动疗法并不能降低血中 TMAO[SMD=-0.12,95%CI(-0.31,0.06),p=0.189]、胆碱[SMD=-0.342,95%CI(-1.093,0.410),p=0.373]、甜菜醛[SMD=-0.704,95%CI(-1.789,0.382),p=0.204]及左卡尼汀[SMD=-0.350,95%CI(-1.906,1.206),p=0.659]的水平。此外,Meta回归分析显示,即使增加菌群驱动疗法干预时间,对结果的效应值亦无改变(P>0.05)。结论:菌群驱动疗法不能降低血中TMAO、胆碱、甜菜碱及左卡尼汀的水平(p>0.05)。即使增加干预时间,对上述效应值亦无改变(p>0.05)。因此,寻找新的可降低血中TMAO水平的干预手段十分必要。研究2 BBR对高胆碱饮食诱导的血栓形成风险作用的研究目的:观察BBR对高胆碱饮食诱导的血栓形成的效应。方法:C57BL/6J随机分为空白组(Chow组)、高胆碱饮食组(Choline组)、高胆碱饮食+BBR组(BBR组)、高胆碱饮食+阳性对照药物组(DMB组)。6周干预后,通过10%的FeCl3溶液外敷暴露的左颈总动脉模型1 min,建立颈动脉损伤模型。采用小动物超声及活体荧光显微镜记录小鼠颈动脉血栓形成时间;采用血小板聚集仪、流式细胞仪,观察血小板聚集率及表面P选择素水平;采用断尾试验,观察小鼠断尾后出血时间。结果:与Chow组比较,高胆碱膳食喂养6周可缩短血栓形成时间、增加血小板聚集率与P选择素的表达(p<0.05);与Choline组比较,BBR干预6周后,可降低血小板聚集率与P选择素水平,延长血栓形成时间(p<0.05),且不增加出血时间(p>0.05);尾静脉注射TMAO后,BBR降低血小板聚集率与P选择素水平、增加血栓形成时间的作用被抑制(p<0.05)。结论:BBR能降低高胆碱膳食诱导的血栓形成风险,TMAO是其发挥作用的关键靶点。研究3 BBR调控TMAO生成的作用及机制研究目的:阐释BBR调控TMAO生成的作用及分子机制。方法:C57BL/6J小鼠随机分为Chow组、Choline组、BBR组及DMB组,6周干预后,观察血浆TMA及TMAO水平。在此基础上,针对胆碱向TMA及TMA向TMAO转化的两个关键环节,采用了肠道菌群厌氧培养、Cut C酶的表达纯化等方法,应用LC/MS、Elisa、PCR、Western Blot等技术研究BBR调控TMAO生成的分子机制。结果:与Chow组比较,高胆碱饮食喂养6周,可显著增加C57BL/6J小鼠血浆中TMA与TMAO水平(p<0.001);与Choline组比较,BBR干预可显著降低血浆中的TMA与TMAO水平(p<0.05)。机制研究发现,BBR对肝FMO3蛋白表达及mRNA水平无影响(p>0.05),亦未能降低肝脏FMO3的活性(p>0.05);但BBR可抑制肠道菌群将胆碱转化为TMA,降低TMA生成。进一步研究发现BBR可直接抑制肠道菌群中Cut C酶活性(IC50=31μM)。结论:BBR可通过抑制肠道菌群中Cut C酶的活性,降低Cut C酶将胆碱转化为TMA。研究4 BBR与Cut C酶的分子对接与分子动力学模拟目的:基于分子对接与分子动力学模拟阐释BBR与Cut C酶的相互作用。方法:(1)分子对接:在RCSB数据库下载Cut C酶3D结构文件,在PubChem Compound数据库下载BBR的3D结构,采用ChemBio 3D进行BBR结构修饰,并将构象保存为mol格式。使用PyMOL修饰Cut C酶结构,并保存为pdb格式供分子对接使用;使用Autodock软件中的图形用户界面工具AutoDock Tools(ADT)中的Hydrogen模块,为Cut C酶添加氢原子;使用Charges模块的Compute Gasteiger分配Cut C酶的局部电荷。导入BBR分子,使用Torsion Tree模块定义BBR的扭转角及可旋转键。根据参考文献中CutC酶的活性口袋,定义CutC酶对接中心为X=-51.504,Y=13.565,Z=-14.899区域的大小为24×22×30,格点间的距离为1A,运行Autogrid,计算格点能量。采用拉马克遗传算法(Lamarckiangeneticalgorithm)进行分子对接,遗传算法中初始种群数、突变概率、交叉概率、最大优化次数等均采用默认参数,每组对进行10次独立对接。(2)分子动力学模拟方法:采用Amber18进行分子动力学模拟,蛋白力场选择amber 99sb-ildn,小分子采用gaff通用力场。首先,将分子对接形成的最优的BBR-Cut C酶复合物置于正方体水盒中,水分子模型选择TIP3P,盒子边缘离Cut C酶最近的距离为1nm。对反应体系进行10000步最速下降法进行能量最小化,然后束溶质分子,对体系进行100ps的预平衡,该过程时间步长2fs,压浴为Berendsen,温浴为V-rescale。静电作用采用PME算法,范德华截断值为1nm,氢原子限制算法为Shake。预平衡结束后,进行50ns的动力学模拟,时间步长2fs,静电作用采用PME算法,范德华截断值为1nm,压浴算法使用Parrinello-rahman,温浴算法采用V-rescale,氢原子限制算法选择hbonds。每20ps保存一次轨迹和能量数据。结果:BBR与Cut C酶的分子对接发现,BBR和Cut C酶的活性口袋形状互补,BBR可紧密的结合在Cut C酶的活性口袋中;Cut C酶活性口袋包括Tyr490,Tyr670,Phe671,Phe677,Tyr788等残基;BBR本身亦具有疏水芳环,可通过与这些疏水性极强的残基的疏水堆积作用和范德华作用稳定的存在于CutC酶的活性口袋中。此外,BBR还可与Cut酶形成2个氢键,且键长较短,强度较大,并且BBR的苯环还与Tyr 670位的苯环之间形成pi-pi堆积作用。进一步分子动力学模拟发现,BBR与Cut C酶结合后的RMSD与ROG波动性较小,其结合自由能可低达-40kcal/mol。结论:分子对接与分子动力学模拟结果说明,BBR可占据CutC酶的活性口袋,两者结合后整个体系稳定,从而抑制了 Cut C酶与胆碱的结合。