人精子蛋白17(sperm protein17, Sp17)是高度保守的睾丸组织特异性蛋白,近年来研究发现其在某些妇科肿瘤组织,特别是卵巢癌组织中特异性高表达,是潜在的卵巢癌靶向治疗的靶点。近年来,随着生物技术在医学领域的快速发展和从分子水平对发病机制的认识,单克隆抗体药物已成为恶性肿瘤靶向治疗领域的研究热点。然而,目前尚未有利用Sp17单克隆抗体治疗肿瘤的研究。本课题拟在前期工作的基础上,利用高表达Sp17的肿瘤细胞和动物模型,一方面考察Sp17单克隆抗体3C12(IgG1单抗)的体内外抗肿瘤活性,并探讨其作用机制；一方面以3C12为靶向载体,将“弹头”药物-阿霉素与抗体偶联,形成3C12-DOX抗体药物免疫偶联物(Antibody-Drug Conjugate, ADC),在确保其抗体免疫活性不受影响的前提下,考察其体内外抗肿瘤活性,靶向性和毒副作用,为研制高效低毒,特异性强的抗卵巢癌抗体靶向药物奠定研究基础。具体内容如下：1.抗Sp17单克隆抗体体外抗肿瘤研究在课题组前期工作的基础上,利用能分泌Sp17单克隆抗体(3C12)的杂交瘤细胞株制备大量单抗,考察其体外抗卵巢癌作用。本研究用ELISA的方法测定抗体效价；选择SKOV3、HO8910和COC2三种卵巢癌细胞为工具细胞,并通过免疫印迹法和免疫荧光法考察三种细胞中Sp17的表达情况；利用MTT法检测3C12对三种细胞的直接毒性作用；利用Cyto Tox96非放射性细胞毒性检测试剂盒考察3C12的抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(ADCC)(?)(?)补体依赖的细胞毒作用(CDC)。结果显示：制备的Sp17单克隆抗体3C12(亚型鉴定为IgG1单抗)具有较高的效价。在三种卵巢癌细胞中,SKOV3细胞异常高表达Sp17,HO8910中等表达Sp17, COC2细胞低表达Sp17；细胞ELISA结果显示3C12单抗与靶细胞结合力强弱与Sp17蛋白的表达量呈正有关,并呈浓度依赖性；MTT法检测发现,不同浓度的3C12单抗(10-4、10-3、10-2、10-1、1和10μg/mL)对以上三种卵巢癌细胞均没有明显的细胞毒作用,说明3C12单抗没有引发细胞内的凋亡通路,或者细胞表面Sp17对于肿瘤细胞的生长没有决定性作用。为了进一步探讨3C12的体外抗卵巢癌活性与初步的机制,对3C12单抗进行ADCC和CDC效应的检测,发现3C12单抗通过ADCC和CDC作用后对SKOV3细胞产生了一定的抑制作用,其最高抑制率分别约为32%和50%；说明效应因子(外周血单个核细胞或补体)可以提高3C12单抗对肿瘤细胞的杀伤作用。2.Sp17免疫偶联物的体内外抗肿瘤活性研究虽然3C12在体外可以通过效应因子抑制肿瘤细胞的生长,但其效果不甚理想。本论文进一步利用3C12作为载体,将其与化疗药物-阿霉素(DOX)偶联,考察其体内外的抗肿瘤活性。体外实验发现,3C12-DOX偶联物作用48和72h时对SKOV3和H08910细胞活力有明显的抑制作用,且对SKOV3细胞的抑制作用强于H08910细胞,而对COC2细胞的活力基本无影响,说明3C12-DOX偶联物的细胞毒作用基于细胞中Sp17的表达量的多少,进一步证实了3C12-DOX的靶向作用。流式细胞术结果也发现在体夕(?)3C12-DOX免疫偶联物可以诱导SKOV3细胞和H08910细胞发生凋亡。在体内实验中,利用SKOV3细胞成功制备了荷瘤裸鼠；在给予连续五周尾静脉注射3C12-DOX免疫偶联物(每周-次)后发现,3C12-DOX明显抑制实体瘤的生长,促进肿瘤细胞凋亡；相对于单独注射DOX组,3C12-DOX组的毒性较低,更加安全。综上,本研究从细胞和整体动物水平探讨了以Sp17为靶点的单克隆抗体(3C12)及其免疫偶联物(3C12-DOX)的抗卵巢癌活性,发现在效应因子的作用下3C12对Sp17+的细胞具有明显的杀伤作用；尤其是3C12-DOX偶联物,其在体内外均具有明显抑制肿瘤的作用,且其安全性优于单独使用化疗药物(阿霉素)。该结果为以Sp17为靶点的肿瘤靶向治疗提供了有力的实验依据,为进一步开发卵巢癌肿瘤靶向药物奠定了理论基础。