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双特异性抗体(bispecific antibody，BsAb)是增强以抗体为基础的肿瘤免疫治疗效果的发展方向之一。BsAb含有两种特异性抗原结合位点，能在肿瘤细胞和免疫效应细胞之间架起桥梁，触发细胞毒反应，产生导向性的杀伤肿瘤效应功能。本研究采用基因工程方法构建了抗HER2／neu×抗CD16 BsAb，并对其抗原结合特性及杀伤HER2／neu过表达肿瘤细胞功能进行了初步研究。本研究分四个部分。1 抗人CD16单克隆抗体可变区基因的克隆、表达及免疫学特性分析采用5’-RACE(rapid amplification of cDNA end，RACE)克隆策略，从分泌抗人CD16单抗的杂交瘤细胞B88-9获得了抗人CD16单抗的重、轻链可变区(VH、VL)及前导肽序列。采用重叠延伸拼接法，通过PCR将VH、VL和Linker Peptide(连接肽)序列在基因水平上拼接，直接合成scFv基因；scFv与人IgG1 Fc区基因片段插入载体pCI-neo构建了scFv-Fc融合蛋白表达载体并在CHO细胞中进行了表达。通过G418筛选获得稳定高表达克隆。更换无血清培养基培养，经重组蛋白A亲和层析柱纯化scFv-Fc融合蛋白。采用人外周血单个核细胞(PBMC)进行双色荧光流式细胞分析，结果表明抗CD16 scFv-Fc能够与表达CD16的CD56+ NK细胞特异结合。2 抗人HER2／neu scFv-Fc融合蛋白的表达及免疫学特性分析为检测抗人HER2／neu单抗VH、VL融合构建的scFv的免疫学特性，将scFv基因与人IgG1 Fc区基因片段插入载体pCI-neo构建了scFv-Fc融合蛋白表达载体并在CHO细胞中进行了表达。通过G418筛选获得稳定高表达克隆。更换无血清培养基培养，经重组蛋白A亲和层析柱纯化scFv-Fc融合蛋白。融合蛋白与乳腺癌细胞SK-BR-3裂解液共孵育可特异性地沉淀出185 kD HER2／neu蛋白；流式细胞分析表明融合蛋白识别HER2／neu蛋白的胞外段；ELISA测定融合蛋白对细胞表面抗原HER2／neu的亲和常数为1． 33×10-9mol／L。3“杵臼结构”修饰CH3结构域构建抗HER2／neu×抗CD16双特异性抗体采用基因工程技术修饰人IgG1 Fc区CH3结构域，将一个CH3结构域的407位大分子酪氨酸(Y)突变为小分子苏氨酸(T)，形成“臼状结构”突变体，在该突变体的N端融合了抗CD16 scFv；将另一个CH3结构域的366位T突变为Y形成“杵状结构”突变体，在该突变体的N端融合了抗HER2／neu scFv。用含有两个突变体的载体共转染CHO／dhfr细胞，有限稀释法克隆化培养，采用G418和MTX博士学位论文中文摘要进行加压筛选。ELISA检测各克隆BsAb表达水平，筛选到一个高表达克隆F7，表达量达到13.4林岁ml。通过逐步降低培养基中的血清浓度，实现了F7克隆的无血清悬浮培养。采用重组蛋白A进行亲和层析纯化，获得了BsAb纯化蛋白。流式细胞分析结果显示BsAb能够与HERZ/neu和CD16分子特异结合。体外实验结果表明，与治疗性单抗HereePtin⑧相比，BsAb能够更加有效介导PBMc对HERZ/n eu过表达肿瘤细胞的杀伤，P<0.001。 4三价双特异性抗体的设计及构建 采用人IgGI重链第一恒定区(CHI)和K链恒定区(CL)结构域作为异二聚化结构域，设计并建立了三价BsAb构建方法。在三价BsAb中，设计与效应细胞以单价结合，体内应用可以避免或减轻全身性效应细胞活化引起的副反应;设计与靶细胞以双价结合，其对靶细胞具有更高的亲和力，增强了导向功能，用于体内治疗时将更快地定位于肿瘤部位。以抗HERZ/n eux抗CD 16 BsAb为例，构建了三价BSAb并在原核系统中进行了表达。