细菌生物膜是指被自身产生的外部多糖基质,纤维蛋白,脂蛋白等包裹着的菌细胞的结构群体,作为一种普遍存在的自然现象,它在细菌的黏附,定植和抗吞噬方面发挥着重要的作用。它赋予细菌对各种因素的抵抗力也是许多持续性和慢性细菌感染的根源。据统计,80%以上的感染性疾病是由被膜菌引发的。在医学上,被膜菌类感染也是慢性顽固性细菌感染的重要原因。由于生物膜内的细菌几乎对所有的抗菌药物都不敏感,表现极强的耐药性,所以严重威胁着人类的生命健康。因此,如果能够寻找到新的破坏细菌生物膜的措施,无疑对阻断细菌的致病作用以及提高其对药物的敏感性进而杀灭耐药菌都有着重要的意义。此外,有效的控制细菌生物膜,在工业、航海业和水产养殖业等领域也具有广阔的应用前景。噬菌体,作为细菌的病毒,能够特异性的感染和裂解细菌。早在上个世纪二十年代,人们首次引入噬菌体来治疗细菌的感染并取得了良好的效果。但随着抗生素时代的来临,这种治疗方法的发展受到了限制。近年来各种耐药性菌株的大量出现,使人们再一次把目光集中到了噬菌体上。噬菌体疗法,顾名思义,就是运用噬菌体及其产物来治疗和预防各种细菌性的感染疾病。尽管噬菌体在90年前就已经被成功的分离,但由于抗生素疗法的大量推广,所以噬菌体在临床上一直没有得到广泛的运用。直到最近,大量耐药性菌株的出现,使得人们不得不寻找一种对付细菌的新方法,运用噬菌体,这种细菌的病毒来治疗细菌性疾病,再一次引起了人们的极大关注。从人类发现噬菌体以来,各种途径运用噬菌体进行的医疗活动已经在很多的国家中展开,并且一直没有噬菌体治疗引发相关严重并发症的报道。因此,噬菌体及其相关产物在临床治疗方面的运用具有广阔的前景。噬菌体要想进入细菌内部裂解菌体细胞,首先必须突破被膜菌表面的糖被,即胞外多糖被(Exopolysaccharide , EPS)。已有研究表明噬菌体的确能够产生多糖解聚酶(polysaccharide depolymerase,PSD)特异性的降解胞外多糖成分,尽管这种“酶学消毒法”只是消解了生物膜,脱掉了被膜菌表面的保护层,但这已经大大消除了被膜菌黏附、定植、抗吞噬的致病性以及对抗生素的耐受性,从而极大的方便了临床上对于被膜菌感染的治疗。本室在国家自然科学基金(30070037)的资助下,已经完成对铜绿假单胞菌噬菌体PaP3的全基因组测序,基因组序列和注释已经登录GenBank(NC 004466)。我们在PaP3基因组中发现PaP3p02基因的编码产物被推定为多糖解聚酶家簇的成员。这种多糖解聚酶基因产物具有降解细菌胞外多糖的作用,使之有可能成为专门破坏细菌生物膜的“酶学消毒剂”。基于此,本文首先克隆了多糖解聚酶全长基因,并成功构建了多糖解聚酶重组质粒,随后经表达、纯化获得多糖解聚酶融合蛋白。最后,通过对多糖解聚酶的体外抑菌活性的鉴定来探讨其作为细菌生物膜酶学降解制剂的应用前景。其研究内容和结果主要包括以下几个方面:1.铜绿假单胞菌噬菌体PaP3多糖解聚酶全长基因的扩增:通过对PCR反应体系与条件的优化,扩增到了多糖解聚酶全长结构基因,为制备多糖解聚酶融合蛋白奠定了基础。2.铜绿假单胞菌噬菌体PaP3多糖解聚酶全长基因的克隆:将多糖解聚酶全长基因插入原核表达载体pQE-31,成功构建了多糖解聚酶重组质粒Pqe-PSD。该重组质粒经位于多糖解聚酶目的片段5’端的BamHⅠ和3’端HindⅢ双酶切鉴定后,对重组质粒进行核苷酸测序,结果表明,重组质粒的序列和阅读框均正确。3.铜绿假单胞军菌噬菌体PaP3多糖解聚酶全长基因的表达与纯化:将多糖解聚酶重组质粒转化大肠埃希菌JM109,获得了表达稳定的多糖解聚酶基因工程菌。在制备融合蛋白包涵体的过程中,发现目的蛋白主要以分泌型表达为主,80%的融合蛋白存在于上清中。在上清中目的蛋白的表达量是包涵体表达量的4倍以上。故对融合蛋白上清行非变性的Ni-NTA柱亲和层析以及目的蛋白的分子筛层析纯化后,能够获得单一条带的目的蛋白,基本无杂蛋白的存在,蛋白纯度在95%以上。说明采用非变性亲和层析可以实现多糖解聚酶融合蛋白的一步纯化。BCA法测定目标蛋白浓度为2.278 mg/ml。4.多糖解聚酶融合蛋白的活性测定:提取铜绿假单胞菌生物膜多糖成分,用挖孔法测定多糖解聚酶对生物膜多糖的降解活性。结果显示,加入重组噬菌体PaP3多糖解聚酶基因蛋白孔中,形成了直径约为1.5cm的透明圆环,而加入PBS(阴性对照)的孔中,无透明抑菌环的形成。初步说明多糖解聚酶基因蛋白对生物膜的胞外多糖具有一定的降解活性。5.多糖解聚酶融合蛋白体外抑菌活性研究:采用微量倍比稀释法测定多糖解聚酶作用前后铜绿假单胞菌PA3对四种敏感抗生素(庆大霉素、环丙沙星、加替沙星、头孢他啶)MIC,MBC的变化,对比结果发现,多糖解聚酶作用后四种抗生素的相应的MIC、MBC都出现了不同程度的降低,其中以头孢他啶降低最为明显。提示多糖解聚酶与抗生素的协同作用具有一定的抗菌活性。采用FITC-ConA/PI荧光双染铜绿假单胞菌PA3生物膜,与通过多糖解聚酶融合蛋白处理的PA3生物膜对照,结果显示多糖解聚酶的处理可降解细菌生物膜胞外多糖结构,视野中可见染成绿色的多糖组分小而分散,包裹在胞外多糖组分里的细菌数量也大大减少。充分说明多糖解聚酶确实能够特异性的降解生物膜的胞外多糖组分并兼有一定的杀菌活性。综上所述,本研究通过对PCR反应体系的优化,扩增到了多糖解聚酶全长结构基因,为制备多糖解聚酶融合蛋白奠定了基础;同时,通过对多糖解聚酶的表达和纯化,拿到了具有活性的重组多糖解聚酶融合蛋白。获得的融合蛋白经体外活性检测证实,对铜绿假单胞菌生物膜胞外多糖成分具有一定的降解活性,为进一步研究其以后在临床上各种抗感染治疗的运用奠定一定的基础。