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目的克隆人促红细胞生成素(hEPO)基因序列,构建hEPO基因的真核表达载体pcDNA3.1 hEPO并在Hela细胞中表达hEPO。方法采用逆转录及巢式PCR方法从人肾组织中克隆hEPO cDNA,将PCR产物亚克隆到pMD18载体并测序。采用定点突变技术纠正PCR过程中产生的碱基突变位点。利用脂质体转染Hela细胞并用Western blot检测hEPO蛋白的表达情况。结果测序结果证实三个碱基突变位点得以纠正,得到序列完全正确的hEPO cDNA。脂质体成功转染Hela细胞后Western blotting检测到hEPO蛋白的表达。结论成功构建了含hEPO基因的表达载体pcDNA3.1 hEPO,并在真核细胞中成功表达。目的比较Uromodulin基因启动子在多种不同真核细胞中表达的特异性及活性。方法对含Uromodulin基因启动子的真核表达质粒pEGFP-URO进行测序鉴定,利用脂质体转染技术,将质粒转染人近端肾小管上皮细胞系(HK-2)、人肾癌细胞系(ACHN)、人膀胱癌细胞系(T24)、大鼠系膜细胞系(HBZY-1),用荧光显微镜和流式细胞仪观察绿色荧光蛋白(GFP)表达的情况。经激发光照射后发出绿色荧光的为阳性细胞,并和pEGFP-N3进行对照研究。结果转染24h后HK-2、ACHN阳性率较高(7-12／HP),流式检测结果为13.2%和11.4%；而T24、HBZY-1阳性率较低(0-1／HP),流式检测结果为0%和0.8%。pEGFP-N3在各组细胞中均有较高表达,其阳性率分别为23.08%(HK-2)、19.24%(ACHN)、26.14%(T24)和18.03%(HBZY-1)。结论小鼠Uromodulin基因启动子在HK-2及ACHN中具有特异性的启动活性,其活性约为CMV的一半。目的克隆Uromodulin基因N’端SP序列和C’端GPI锚定序列,利用EGFP在肾小管上皮细胞中验证其膜定位功能。方法采用逆转录PCR方法从小鼠肾组织中克隆Uromodulin cDNA全长序列,利用巢式PCR克隆出Uromodulin基因的N’端SP序列和C’端GPI锚定序列。与报告基因EGFP构建真核表达质粒pN3 SP-EGFP-GPI,转染上皮细胞系HK-2后在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达及膜定位情况。结果成功获得Uromodulin基因C’端的GPI锚定序列,经测序与预计序列一致。pN3SP-EGFP-GPI转染HK-2细胞后在荧光显微镜下观察到绿色荧光,其中大部分定位于细胞膜。结论利用Uromodulin基因的SP/GPI序列能够将外源表达蛋白定位于上皮细胞膜。