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背景:组蛋白甲基转移酶Histone-lysine N-methyltransferase 2D(KMT2D)是主要的组蛋白3第4位赖氨酸(Histone 3 lysine4,H3K4)甲基转移酶,在组织中广泛表达,并且在调控胚胎发育、分化和代谢过程中发挥关键作用。H3K4的甲基化(methylation)作为组蛋白修饰的一种类型,通过结合在基因的增强子与启动子区域激活基因转录。前期研究报道在小鼠胚胎期敲除Kmt2d基因会导致小鼠心脏发育不全而死亡。我们团队的研究发现,在成年小鼠心脏中特异性敲除Kmt2d,进行心梗手术后梗死面积与对照组相比明显增加,血管再生能力下降。低氧诱导因子-1α(Hypoxia-inducible factor 1,HIF-1α)是调控细胞应对低氧状态的关键转录因子,在心肌缺血缺氧条件下,HIF-1α表达上调,从而调节下游相关基因的表达,以减少心肌受损。此外,HIF-1α调控其下游基因表达存在一定的选择性,即在不同生理病理条件下对基因有不同程度的调控。有研究表明,表观遗传修饰在基因的转录调控过程中发挥重要作用,包括组蛋白甲基化、乙酰化等对HIF-1α的稳定性和转录活性的调控。然而,对于KMT2D是否参与低氧条件下HIF-1α对下游基因的转录调控过程尚未见报道。目的:探索低氧状态下组蛋白甲基转移酶(KMT2D)在心肌细胞H9c2中的作用,以及KMT2D对低氧诱导因子-1α(HIF-1α)下游基因转录水平的调控作用。方法:(1)低氧模型的构建及低氧状态下相关蛋白表达量的检测。本实验选用大鼠H9c2心肌细胞株,在含1%O2,5%CO2的37℃恒温孵箱中分别进行低氧培养Oh,4h,8h,16 h,24h,以建立低氧培养模型并诱导HIF-1α蛋白的积累。采用核和胞浆提取试剂盒分离胞核和胞浆蛋白,用Western blotting方法检测不同低氧时间点HIF-1α,P300,KMT2D和其介导的H3K4 mono-methylation(H3K4mel)的蛋白表达水平。(2)检测HIF-1α下游基因的转录。使用实时荧光定量 PCR 技术(quantitative real time polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测HIF-1α下游基因Vegf和Bnip3的mRNA表达水平。(3)采用染色质免疫共沉淀技术(Chromatin immunoprecipitation,ChIP)探索低氧处理 H9c2 细胞 16h 后,H3K4me1和H3K27ac在Hif-1α和Vegf启动子区域的结合情况。(4)探究KMT2D对HIF-1α下游基因转录的影响。采用小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)技术沉默Kmt2d基因,实验分为四组:Negative siRNA(Negative control,NC)组、siKmt2d组、Negative siRNA+Hypoxia(NC+H)组、siAKmt2dd+Hypoxia(siKmt2d+H)组,转染 48h 后进行低氧处理 8 h。Westemblotting 检测 H3K4me1 和 HIF-1α的蛋白表达,qRT-PCR 检测Kmt2d,Vegf,Bnip3和Glut1的mRNA表达水平。(5)在组蛋白去甲基化酶LSD1抑制剂(RN-1)的干预下,检测H3K4me1的表达水平。采用不同浓度梯度LSD1抑制剂处理细胞,筛选有效浓度;沉默Kmt2d48 h后,加入LSD1抑制剂,Western blotting检测H3K4me1蛋白表达。结果:(1)低氧条件下,H9c2细胞中HIF-1α/P300/KMT2D/H3K4me1蛋白表达增加。HIF-1α蛋白量积累在8h达到高峰,16h和24h积累量下降;P300蛋白量在4h和8h明显增加;KMT2D蛋白在低氧8h后表达量最高,16h和24h保持高表达;H3K4me1蛋白水平在16h出现明显上调。(2)HIF-1α下游基因的转录水平上调。qRT-PCR的结果显示Vegf表达水平在低氧处理后4 h显著增加,24 h达到最高;Bnip3同样在低氧处理4 h后显著增加,16h达到最高,24h有所下降。(3)ChIP-qPCR结果表明低氧处理16h后,H3K4me1在Vegf启动子区域的结合增加;H3K27ac在Ff-1α和Vegf启动子区域的结合均明显增加。(4)沉默Kmt2d之后HIF-1α下游基因Vegf和Glut1出现不同变化趋势。在低氧和常氧条件下与NC组比较,siKmt2d组的Kmt2dmRNA水平明显下降;siKmt2αd+H组H3K4me1的蛋白水平与NC+H组相比明显下调。与siKmt2d组相比,siKmt2d+H组的HIF-1α蛋白水平没有明显上调。HIF-1α下游基因Vegf,Bnip3和Glut1的mRNA表达水平出现差异,Vegf的表达水平在NC组和siKmt2d组间没有差异,而与NC+H组相比,siKmt2dd+H组的表达下降;常氧和低氧条件下Bnip3的表达水平在NC组和siKmt2d组之间没有改变;Gut1的mRNA表达在NC组和siKmt2d组没有差异;与NC+H组比较,siKmt2d+H组的表达水平明显上调。(5)LSD1抑制剂干预初步结果表明,常氧状态下4μM LSD1抑制剂能够使H3K4me1蛋白表达增加;沉默siKmt2d后加入LSD1抑制剂(RN-1)干预24 h再进行低氧处理8 h后的H3K4me1蛋白水平没有受到明显影响。结论:在低氧条件下,组蛋白甲基转移酶KMT2D对H[F-1α下游基因转录有调控作用,并可能参与HIF-1α下游基因转录选择性的调控。