前言 新生儿窒息是新生儿死亡和伤残的主要病因之一。本病致死致残的主要原因是窒息缺氧造成多脏器（心、脑、肾等）损伤所致。由于肾组织能量消耗大，肾血流量多，使其成为对缺血缺氧最敏感的器官。窒息后肾损伤发生率高，并且无特殊临床表现，早期诊断困难，往往在肾损伤达严重程度才被发现，因此，对其发病机制的研究和防治一直是儿科医生面临的重要课题。 新生儿窒息主要发生在宫内，约80～90％在产前或产时。由于宫内急性缺血再灌注模型的建立，围产期肾损伤发病机制的研究已取得了初步进展。业已证实，炎症反应是缺血缺氧再灌注肾损伤的重要发病机制之一。环氧化酶（Cyclooxygenase，COX）是与炎症相关的酶，在人体内有二种亚型，COX-1为结构型；COX-2为诱导型。由于COX-2在生理状态下呈低拷贝数表达，而在缺氧、脂多糖、IL-1、TNF、表皮生长因子和血小板活化因子等许多炎症刺激因子作用下大量诱生，因此，近年来有关COX-2在缺血缺氧再灌注炎症反应中作用的研究已成为人们研究的热点。大量研究显示：COX-2蛋白和基因表达在缺血缺氧再灌注后显著上调，但是由于代谢产物的不同，COX-2在不同组织缺血缺氧再灌注损伤中的作用也有所不同。目前为止，COX-2在缺血再灌注肾损伤中的作用并不十分清楚。它在宫内缺血缺氧再灌注损伤后胎鼠肾组织中表达的变化，国内外尚未见报道。PKC（Protein kinase C）是Ca²⁺／磷脂依赖性蛋白激酶，它在跨膜信号传导，细胞 博士研究生论文增殖分化及基因表达等方面都发挥着重要的调节作用。大量研究显示：PKC在缺血缺氧再灌注肾损伤后被激活，并与COXZ基因表达密切相关。 基于以上原因，本研究以胎龄ZI日胎鼠为研究对象，应用分子生物学方法检测宫内缺血缺氧及再灌注后胎鼠肾组织COX的蛋白和基因表达，利用放射免疫技术，测定胎肾组织 COX主要代谢产物 PGE卜 6七etoIGF；JhB。水平的变化；采用改良的Tabal法检测缺血再灌注后肾组织细胞内信号传导系统PKC活性的变化，分析其与COX基因表达的关系，以试图从分子水平探讨COX系统在宫内缺血缺氧及再灌注肾损伤发病机制中的作用，从而为围产期肾损伤的预防和治疗提供理论依据。 材料与方法 1．动物模型 孕21日SD大白鼠腹腔麻醉后，下腹正中切口，暴露双角子宫及供应子宫和卵巢的动静脉血管，以无创动脉夹钳央一侧血管，对侧未钳夹宫角内的胎鼠为对照组（假手术组人钳夹时间为30分钟，这要求时间后取下动脉夹行再灌注，再灌注时间分另为0分钟，30分钟，2小时，6小时，12小时，24小时，30小时。在PKC活性检测时，增加缺血15分钟，再灌注15分钟，再灌注45分钟，再灌注1小时组。 2．标本采集和处理 模型一旦满足条件后，立即剖宫取鼠，断头处死，取出完整胎肾，按以下方式分别保存：①标本置于10％中性福尔马林中固定。②标本置于液氮中冻存。③标本置于一70℃低温冰箱中保存。④无菌条件下取材，置于去RNA酶的EPPendod管中，－80℃冻存。 3．实验方法 1川E染色：固定后的组织常规脱水，包蜡，切片，行HE染色，在光学显微镜下观察肾组织形态学改变； 2）放射免疫测定：将不同时间点的肾组织分别称重后匀浆，采用放射免疫法测定肾组织PGEn及PGI。和IXA。的稳定代谢产物6上eto｝GF；川h民的动态变化。 3)免疫组织化学：利用COX＊人 特异性抗体，采用链菌素亲生物 ·2·博士研究生论文素一过氧化酶免疫组化方法（简称SI法）检测肾组织COX4 COXZ表达及定位。 4)Western blotting：将肾组织匀浆后，提取细胞膜蛋白，利用 COX＊。COXZ特异性抗体，用Western杂交检测不同时间点COX＊人OX－2蛋白表达量的变化。 5)RT工CR半定量测定：用TAIZOL总RNA提取试剂提取肾组织RNA，反转录合成CDNA的第一链，分别扩增COXlJ PCR产物，再经凝胶成像及分析系统扫描PCR产物，以P吃ctin为内参照标化COX－1人OX－2量。 6冲KC活性测定：将不同时间点肾组织标本分别匀浆后，分离细胞膜蛋白和浆蛋白。同位素［y－’则标记 ATP，用改良的 Tabal法测细胞膜和细胞浆PKC活性。用酚试剂法测定蛋白浓度，计算比活性。 4．统计学分析：所得数据用均值。标准差＊。S)表示，统计分析采用Dunnett t检验和 q检验。 结 果 1．缺血30分钟无再灌注时，胎肾组织学仅为肾浊肿表现，近曲小管上皮细胞肿胀，管腔变小，胞浆内充满粉染物质；再灌注6小时时，近曲小管轻度扩张，并出现空泡变性，肾小球充血，随着再灌注的延续，近曲小管扩张加重，管腔内有渗出；再灌注24小时，近曲小管空泡变性加重，管腔消失，出现部分片状坏死；再灌注30小时上述改变加重，近曲小管大片状坏死，肾小管结构不清，病理改变最为严重。 2．在正常胎鼠肾组织，COX4定位于