黄曲霉毒素B₁（AFB₁）分布广泛,可以致癌、致畸和致突变,且在食品中检出率较高,严重威胁人类和动物的健康。酶联免疫分析技术和胶体金免疫层析技术因其特异性强、高通量、简单快速、低成本等优点成为检测黄曲霉毒素的常用方法之一。然而,随着人们对食品安全和质量的要求越来越严格,这两种免疫学分析方法由于其检测灵敏度偏低的局限性,已经无法满足某些实际应用的需求。因此如何提高这两大免疫学检测方法的灵敏度已成为当前亟待解决的主要问题。驼源性纳米抗体作为目前体积最小的基因工程抗体,具有稳定性高、生产周期短、产量高,易于遗传信息改造、成本低等优点,已经被广泛应用于食品安全检测等领域。为了提高酶联免疫分析技术和胶体金免疫层析技术的检测灵敏度,本文以驼源性纳米抗体为主要实验材料,紧紧围绕着提高检测信号的灵敏度和改进免疫学元件亲和力两个策略进行了如下研究:1生物素化纳米抗体的制备及应用的研究（策略一:提高检测信号的灵敏度）通过化学生物素法和酶催化生物素法标记纳米抗体,得到了三种生物素化纳米抗体,即G8-L-Biotin（长臂）、G8-S-Biotin（短臂）和G8-Biotin（酶催化法）。分别建立了基于这三种抗体的BAS-ELISA（Biotin（strept）avidin system enzyme-linked immunosorbent assay）,得到其IC₅₀为7.71 ng/mL（G8-L-Biotin）、3.85 ng/mL（G8-S-Biotin）和1.30 ng/mL（G8-Biotin）。由此可见,基于G8-Biotin建立的BAS-ELISA其灵敏度比基于其它两种抗体建立的方法学（BAS-ELISA）的灵敏度分别提高了6倍和3倍。以G8-Biotin和生物素链霉亲和素系统建立了检测谷物中AFB1的BAS-FLEIA（Biotin（strept）avidin system plus fluorescent enzyme-linked immunosorbent assay）,该方法的半抑制浓度(IC₅₀)为0.26 ng/mL,检测限（LOD）为0.03 ng/mL,线性范围(IC₂₀-IC₈₀)为0.09-0.74 ng/mL,与其它四种真菌毒素（DON、FB₁、OTA、ZEN）未见有明显的交叉反应,加标回收率为96-112.8%、变异系数为3.28-9.07%。2纳米抗体-纳米荧光素酶（G8-Nluc）的融合表达、活性分析及其应用的研究（策略一:提高检测信号的灵敏度）制备了纳米抗体-纳米荧光素酶（G8-Nluc）融合蛋白,选择CTZ-Native、CTZ-400a和CTZ-H三种CTZ类似物作为纳米荧光素酶的底物,对G8-Nluc中纳米荧光素酶的活性进行分析,结果显示,纳米荧光素酶具有良好的活性,初始发光强度（RLUmax）的顺序是CTZ-H（2.3×10⁶）>CTZ-400a（1.5×10⁶）>CTZ-天然（2.5×10⁵）,与其他两种类似物相比,CTZ-H显示出最强的信号,因此选择CTZ-H作为纳米荧光素酶的最佳反应底物;为了增加反应的最大发光强度和延长反应的半衰期,确定了最佳的缓冲液（pH=8.0,含有1%Tergitol NP-10的10 mM PBS,0.25 mg/mL BSA和8.80 mM EDTA.Na₂）,与商业化Glo-lysis和Passive lysis缓冲液相比,该缓冲液配方最大发光强度分别提高了1.50倍和1.80倍,最大发光强度的半衰期延长了2.50倍和9倍,可用于基于纳米荧光素酶及其融合蛋白的高通量免疫测定。以G8-Nluc融合蛋白为检测探针,建立了谷物中AFB₁的一步生物荧光酶联免疫分析法BLEIA（bioluminescent enzyme immunoassay）。该方法的IC₅₀为0.41ng/mL,线性范围为0.10-1.64 ng/mL。基于G8-Nluc融合蛋白的BLEIA的灵敏度比基于G8纳米抗体的经典两步ELISA(IC₅₀=8.14 ng/mL)灵敏度提高约20倍,玉米和燕麦的加标回收率分别为98-113%和91-106%,变异系数分别为2.56-9.47%和4.00-8.25%,与其它四种真菌毒素（DON、FB₁、OTA、ZEN）未见有明显的交叉反应。3基于五价纳米抗体单体的免疫层析检测技术及其应用的研究（策略二+策略一:改进免疫学元件亲和力+提高检测信号的灵敏度）构建了G8-CTB原核表达载体pET25b-CTB-G8,并将其转化到E.coli BL21（DE3）感受态细胞中,表达纯化后获得了G8-CTB五聚体的单体;采用种子增长法制备花状纳米金（AuNFs）溶液,将G8-CTB与花状纳米金AuNFs（Gold nanoflowers,AuNFs）进行偶联,制备金标探针,通过优化NC膜种类、抗原AFB₁-BSA和金标探针的量,成功研制了检测AFB₁的免疫层析方法,该法裸眼可视检出限为1 ng/mL、检测时间只需10 min,耐受30%甲醇浓度,无需专业人员和仪器,可直接目测其结果,特别适合现场快速检测。4纳米抗体随机突变文库的构建淘选和分析采用易错PCR方法,通过对Mg²⁺浓度、Mn²⁺浓度、TritonX-100浓度进行单因素试验,建立了随机突变文库,初步判定该突变文库的阳性率为89%,突变文库的有效库容量为5.96×10⁶ cfu,用辅助噬菌体M13K07救援后,突变文库容量为2.10×10¹33 cfu/mL,随机挑选10个阳性克隆进行测序分析显示,突变子均为单个基因突变且分布比较均匀。以人工抗原AFB₁-BSA为靶分子进行五轮的固相亲和淘选,经过间接竞争phage-ELISA鉴定,结果显示,突变子5-34活性消失,5-23阳性克隆的灵敏度比野生型的提高了2.10倍,5-21、5-24的灵敏度较野生型的分别降低了6.37倍和10.55倍,5-20、5-22和5-25灵敏度无显著变化。分析测序结果显示,FR2区第45位赖氨酸（45K）突变为精氨酸（45R）,第46位的谷氨酸（E）突变为琥珀密码子,可以提高突变子的活性,而FR1区第三位的谷胱氨酸（3Q）和FR3区第93位的苏氨酸（93T）同时突变则使突变子的活性显著降低甚至消失。