1997年5月，重庆动物园3只大熊猫发病，经强心，补液和抗菌消炎等治疗措施，收效甚微，于6月22日两只26岁的大熊猫死亡。胡桂学等人利用犬肾传代细胞对送检的死亡大熊猫肝、脾等病料进行了病毒的分离和鉴定研究，结果成功地分离获得了1株病毒(命名为DXMV)。电镜负染检查细胞培养物，见有冠状病毒样粒子。为进一步鉴定，胡等人利用能扩增出11种冠状病毒的简并核苷酸引物进行RT-PCR扩增，结果证明该病毒是冠状病毒属中的一员。根据国外已发表的CCV-K378株的S基因序列设计了一对引物，扩增出了1086bp的目的基因片段(S基因第81-1166位)，通过基因的序列测定和分析比较，证明了该株病毒为犬冠状病毒(CCV)。本研究是在完成大熊猫肝脏分离病毒的鉴定的基础之上，对CCVDXMV的S基因其它部分进行基因扩增、克隆和序列测定，并与其它CCV株的S基因序列进行同源性分析。 犬冠状病毒只有一个血清型，但不同地区和动物来源的毒株在毒力和分子生物学方面不尽相同。病毒基因的克隆和序列测定是分析病毒遗传特征的最佳方法。CCV的S基因所编码的S蛋白是病毒最大的结构蛋白，由1452个氨基酸组成(Insavc-1株)，是病毒粒子中较保守的蛋白质。病毒进入机体后，首先接触到的就是S蛋白，其作用是与细胞受体结合，引起细胞融合，刺激机体产生中和抗体和细胞介导的细胞毒成分。因此S蛋白是CCV致病力和宿主特异性的主要决定因子，但目前有关犬冠状病毒S蛋白和基因的变异研究报道较少。本研究以测定该株CCV的S基因序列为主要研究内容，目的在于研究其分子生物学特征，探讨其S基因与其它株的差异，从而为犬冠状病毒病的基因工程疫苗研究提供科学依据，也为大熊猫的病毒性疾病的防治奠定基础。 由于CCV的S基因很大，一次扩增整个基因的难度很大。该株病毒是新分离古林农业大学硕士学位论文大熊猫犬冠状病毒s墓因的扩增、克隆和序列分析的ccv毒株，病毒滴度低，增加了RT一PcR的难度。所以本实验设计了半套式PcR引物分段扩增s基因。根据GeneBank中发表的ccv K378株基因序列，利用软件Primer Premiers .0共设计了六条引物(sFZ一sRZ，sF3一sR，，sR工3，sF工，)，其中sF:一sRZ扩增出了792bP的基因片段;sF3一sR，为外层的半套式引物，sR工3、sF工3分别为内层的半套式引物，分别扩增出了737bP和1178bP的基因片段。同时根据ccv工n。av。一i株基因序列设计了引物sF:一sR:，sF。一sR。和sP工.。sF:一sR:扩增368bp的片段，sP。一sR.和sFI‘用于套式扩增985bP的基因片段。将各部分的PcR产物纯化，并分别克隆入PGEM一T载体中，用PcR和限制酶酶切两种方法鉴定重组质粒，然后将阳性重组菌送生物公司测序。5个s基因片段合并起来囊括了s基因的81一1 166位以外的全部序列，序列用生物软件编辑除去各部分重复序列和引物序列，得到s基因的全部序列。 将eev DxMV的s基因序列和其它eev毒株、Te卿卿2 002和F工Pv 79一11连6的s基因序列用DNAStar和DNAsi。作多重比较，并绘制了进化树。核普酸序列分析比较表明，该病毒与ccv NvsL和K378株的同源性最高，可达到9 9 .5%;而与eev 23/03的同源性最低，为56 .9急;与F工四和TGEv分别有90.理龟和52 .1龟的同源性。DxMV与K3 78、eev6、eev v54、FxPv79一1146、TGEv姗2002和eCv 23/03的氨基酸序列同源性分别为:99.0龟、97.1龟、96.1龟、92.7龟、81.3%和50.0%。 本研究对大熊猫分离的犬冠状病毒的部分s基因进行了克隆和序列分析，为大熊猫的疾病防治工作提供了必要的信息和资料，同时也丰富了犬冠状病毒的分子生物学研究内容。