新生隐球菌（C. neoformans）是临床上常见的条件致病真菌，具有明显的嗜神经倾向，主要引起免疫抑制人群的新生隐球菌性脑膜炎及脑膜脑炎，而我国感染人群主要以免疫正常者为主。新生隐球菌外层有荚膜包裹，根据荚膜多糖凝集实验可分为4种主要的血清型，其中，我国大陆地区主要以A血清型为主。免疫吞噬细胞在新生隐球菌感染与发病过程中有着重要的作用，小胶质细胞作为中枢神经系统的巨噬细胞，在新生隐球菌进入宿主中枢神经系统后发挥重要的免疫防御作用。在INF-γ存在的情况下，小胶质细胞膜表面MHC-Ⅱ分子表达增强，提高对中枢神经系统新生隐球菌感染的免疫力。然而，在缺乏细胞因子刺激的情况下，则C.neoformans可在小胶质细胞内存活并繁殖，最终引起小胶质细胞的破裂。能量代谢是宿主细胞赖以生存的重要生化过程，在维持细胞各项活动中有着重要的作用。研究显示，众多的病原体感染宿主细胞后导致宿主细胞能量代谢水平受到影响，甚至会导致细胞的凋亡或坏死。氧化磷酸化（OXPHOS）系统嵌入在线粒体膜脂质双层的内膜部分，是细胞能源生产的最终生化途径。许多的研究显示，病原体感染宿主细胞后，对宿主能量代谢的影响主要表现在对氧化磷酸化作用的抑制作用。因此，氧化磷酸化作用在维持细胞内稳态及细胞活性功能中发挥着重要的作用。线粒体作为能量代谢的器官，不仅为宿主细胞活动提供能量，同时也是凋亡过程的枢纽环节，因此线粒体途径在诱导宿主细胞凋亡过程中有着非常重要的作用。有关新生隐球菌引起的脑膜炎动物模型的研究表明坏死并不是新生隐球菌肉芽肿的特性，炎症器官中炎症细胞经历凋亡才是主要机制。同时，小胶质细胞对无荚膜或小荚膜的新生隐球菌的吞噬作用比野生株强，说明新生隐球菌的荚膜具有抗吞噬作用，提示荚膜可能通过诱导细胞凋亡来实现抗吞噬作用。本课题组通过体外实验发现无荚膜隐球菌CAP64也可以诱导小胶质细胞凋亡，这提示除荚膜外新生隐球菌的其他毒性因子也可以诱导宿主细胞凋亡，但是具体的机制尚不明确。我们认为在新生隐球菌感染小胶质细胞后，新生隐球菌通过影响小胶质细胞的氧化磷酸化水平而对小胶质细胞的活性产生作用，甚至进一步通过线粒体途径诱导细胞的凋亡。本实验中，我们采用了A血清型新生隐球菌野生株H99以及同基因型的荚膜突变株CAP64为研究对象，主要对小胶质细胞感染新生隐球菌后氧化磷酸化水平的改变及凋亡机制进行探索。本研究主要分为以下四个部分：第一部分新生隐球菌GXM对BV-2细胞氧化磷酸化作用及其凋亡的影响GXM是新生隐球菌荚膜多糖中最为重要的毒力因子，一直以来被认为是对宿主细胞产生重要调节作用的免疫成分。本部分研究在获得纯化的GXM的基础上，观察GXM对小胶质细胞氧化磷酸化水平和凋亡的影响。采用CCK-8法检测GXM体外对小胶质细胞活性的抑制作用。进行GXM体外诱导小胶质细胞凋亡实验时，采用TNF-α和IFN-γ预处理小胶质细胞，模拟炎症条件下进行GXM对小胶质细胞的干预作用，并采用AnnexinV-FITC/PI双标记法流式细胞术检测各组细胞的凋亡率。采用超微量ATP含量测试盒检测，根据公式（ATP浓度（umol/gprpt）=（测定管OD值-对照管OD值）/(标准管OD值-空白管OD值)×标准管浓度（1×103umol/ml）×样品前稀释倍数÷待测样本蛋白浓度（gprot/l））计算GXM干预后小胶质细胞ATP含量。实验结果显示GXM（50ug/ml）体外可抑制小胶质细胞的活性和氧化磷酸化水平，GXM干预后小胶质细胞产ATP水平较对照组下降(P<0.05)，流式细胞仪检测发现GXM独立作用于小胶质细胞时并不能明显引起小胶质细胞凋亡率的改变，但在IFN-γ的协同作用下可以明显提高神经小胶质细胞的凋亡率，而TNF-α并无此作用。提示在新生隐球菌感染宿主细胞后产生的细胞因子中IFN-γ在对新生隐球菌产生杀伤作用的同时，对于宿主细胞的本身也可能造成一定的损伤。第二部分新生隐球菌对神经小胶质细胞氧化磷酸化作用的影响氧化磷酸化作用是宿主细胞能量代谢的最后一个环节，是产生维持生命活动的能量的重要步骤。大量的研究表示病原体感染之后可以影响宿主细胞的能量代谢水平。本研究通过基因芯片技术筛选出新生隐球菌作用小胶质细胞后氧化磷酸化通路上差异表达的基因，并通过RT-PCR技术进行验证。发现复合体I组成部分之一的NDUFA4基因以及编码ATP合成酶的ATPase6V基因的表达水平均较对照组有所下降。后续的ATP水平检测同样证实了新生隐球菌对宿主细胞能量代谢作用的影响。同时，H99组和CAP64组同对照组比较均有统计学意义（P值均<0.05），但两处理组间无明显差异（P>0.05）,说明荚膜在新生隐球菌对小胶质细胞能量代谢的影响中并不起决定性的作用。新生隐球菌野生株与荚膜缺陷株体外均能诱导神经小胶质细胞的凋亡，证明了除去荚膜成分以外的菌种成分也能诱导神经小胶质细胞的凋亡。有可能是新生隐球菌的直接作用，或者是通过诱导神经小胶质细胞炎症因子的产生而促进宿主的凋亡。新生隐球菌感染神经小胶质细胞后，会导致其氧化磷酸化过程中电子传递链的损伤从而影响氧化磷酸化水平而使得产能量代谢水平下降。能量代谢水平下降必然会导致宿主细胞的免疫活性功能下降。说明，通过影响宿主细胞能量代谢也是新生隐球菌引起宿主致病或者逃避宿主免疫杀伤的一个可能机制。第三部分新生隐球菌体外诱导小胶质细胞凋亡机制的研究诱导宿主细胞凋亡是病原体逃避宿主免疫杀伤或对宿主细胞造成损伤的重要机制之一，新生隐球菌同样具有这样的能力。依据第二部分的研究结果，我们推测线粒体在新生隐球菌诱导宿主细胞凋亡过程中有着重要的作用。采用Western-blot的方法检测新生隐球菌干预宿主细胞后线粒体凋亡途径通路上重要蛋白表达水平的差异，其中主要包括:Cyt C的释放, Caspase3、 Caspase9、凋亡抑制蛋白Bcl-2以及凋亡促进蛋白Bax。经检测发现新生隐球菌感染小胶质细胞后，小胶质细胞Cyt c线粒体内表达水平较对照组下降，胞浆内表达水平上升，提示新生隐球菌可作为凋亡因素促使宿主细胞线粒体内的Cyt c释放入胞，而进一步引起下游的凋亡程序的启动，使得凋亡蛋白表达水平上升，而凋亡抑制蛋白的表达水平下降，提示线粒体凋亡途径在新生隐球菌诱导小胶质细胞凋亡过程中有着重要的作用。第四部分新生隐球菌性脑膜炎动物模型中炎症脑组织细胞凋亡机制的研究采用滴鼻吸入的方式通过呼吸道构建小鼠新生隐球菌性中枢神经系统感染模型，利用组织病理和感染组织匀浆涂片的方法检测模型构建成功与否。Western-blot技术检测新生隐球菌感染后宿主脑组织炎症细胞Cyt C释放情况，发现实验组胞质内Cyt C表达水平较对照组提高，线粒体内Cyt表达水平较对照组下降；同时，实验组Caspase3、9和Bax的表达水平均较对照组提高，而Bcl-2表达水平较对照组下降。成功构建小鼠新生隐球菌脑膜炎吸入模型，为模拟新生隐球菌自然感染状态提供动物研究模型。Western-blot技术检测新生隐球菌感染后宿主脑组织炎症细胞Cyt C释放情况，发现实验组胞质内Cyt C表达水平较对照组提高，线粒体内Cyt表达水平较对照组下降；同时，实验组Caspase3、9和Bax的表达水平均较对照组提高，而Bcl-2表达水平较对照组下降。结合第三部分的体外实验结果，提示新生隐球菌可通过线粒体途径诱导宿主细胞凋亡。总结：1. GXM作为新生隐球菌荚膜的重要的成分，体外对小胶质细胞的活性存在明显的抑制作用，但独立作用于小胶质细胞时，并不能诱导小胶质细胞的凋亡率的增加。在炎症因子IFN-γ的协同作用下可促进小胶质细胞的凋亡。2.新生隐球菌感染小胶质细胞后可降低宿主细胞的氧化磷酸化水平，抑制宿主的能量代谢，导致宿主产ATP能力下降，且荚膜在该过程中的作用并不明显。3.通过滴鼻吸入菌悬液的方式可以构建稳定的小鼠新生隐球菌性脑膜炎模型。4．通过体外细胞实验以及动物体内外实验的证实新生隐球菌可以通过线粒体途径诱导宿主感染细胞的凋亡。